Изучая белка импорта в хлоропластов, используя протопластов
Summary
Здесь мы описываем протокол выразить белков в протопласта, используя метод PEG-опосредованной преобразования. Этот метод обеспечивает простой выражение протеинов интереса, и эффективное расследование локализация протеина и процесс импорта для различных экспериментальных условий в vivo.
Abstract
Хлоропластов является важным органелл, который отвечает за различные клеточные процессы в растениях, таких как фотосинтез и производство многих вторичных метаболитов и липиды. Хлоропласты требуют большое количество белков для этих различных физиологических процессов. Более 95% белков хлоропласта ядро кодировке и импортированы в хлоропластах от цитозоль после перевода на цитозольной рибосом. Таким образом правильного импорта или ориентации этих белков ядро кодировке хлоропластов в хлоропластах имеет важное значение для надлежащего функционирования хлоропластов, а также растительной клетки. Ядро кодировке хлоропласта протеины содержат сигнальные последовательности для конкретной ориентации в хлоропластах. Молекулярные машины, локализованные в хлоропласте или цитозоль признать эти сигналы и выполнения процесса импорта. Для изучения механизмов импорта белка или ориентации хлоропластов в естественных условиях, мы разработали быстрого, эффективного метода, основанного на протопластов, для анализа белка импорта в хлоропластах арабидопсиса. В этом методе мы используем протопласта, изолированных от листовой ткани Arabidopsis. Здесь мы предоставляем подробный протокол для использования протопласта исследовать механизм, по которому белки импортируются в хлоропластах.
Introduction
Хлоропластов является одним из наиболее важных органеллы в растениях. Одна из основных функций хлоропласты — осуществлять фотосинтез1. Хлоропласты осуществляют также многих других биохимических реакций для производства жирных кислот, аминокислот, нуклеотидов и многочисленные вторичные метаболиты1,2. Для всех этих реакций хлоропласты требуют большое количество различных типов белков. Однако хлоропласта геном содержит только около 100 генов3,4. Таким образом хлоропласты необходимо импортировать большинство их белков из цитозоль. В самом деле большинство белков хлоропласта были продемонстрированы быть импортированы из цитозоль после перевода4,5,6. Клетки растений требуют конкретных механизмов для импорта белки из цитозоль в хлоропластах. Однако хотя эти механизмы импорта белка были изучены в течение последних нескольких десятилетий, мы до сих пор не полностью понимаем их на молекулярном уровне. Здесь мы предоставляем подробный метод для подготовки протопласта и экзогенно выражая генов в протопласта. Этот метод может быть ценным для выяснения молекулярные механизмы лежащие в основе белка импорта в хлоропластах в деталях.
Белка импорта могут быть изучены с использованием многих различных подходов. Один из этих методов включает в себя использование в vitro белка импорта7,системы8. Используя этот подход, в пробирке-перевод белка прекурсоров инкубируют с очищенной хлоропластов в пробирке, и белка импорта анализируемой SDS-PAGE, а затем Западный анализ помаркой. Преимуществом этого подхода является, что может подробно каждый шаг белка импорта в хлоропластах. Таким образом этот метод широко используется для определения компонентов молекулярного механизма импорта белка и анализировать сведения о последовательности для транзита пептидов. Совсем недавно был разработан еще один подход с использованием протопласта из листьев тканей, и он стал широко используется для изучения белков импорта в хлоропластах9,10. Преимуществом этого подхода является, что протопласта обеспечивают клеточной среды, которая ближе к нетронутым клеток, чем система, в пробирке . Таким образом система протопластов позволяет нам решать многие дополнительные аспекты этого процесса, например связанные события цитозольной и как определяется специфика ориентации сигналов. Здесь мы представляем подробный протокол для использования протопласта для изучения белков импорта в хлоропластах.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы предоставили подробный протокол для использования протопласта Arabidopsis для изучения белков импорта в хлоропластах. Этот метод является мощным для изучения процесса импорта белка. Этот простой, универсальный метод полезен для изучения нападения на предполагаемых грузов белков в…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была проведена с поддерживает программы совместных исследований для сельского развития науки и технологий (проект № PJ010953012018), Управление по развитию сельских районов и Грант Национальный исследовательский фонд (Корея), финансируемого министерством науки и ИКТ (№ 2016R1E1A1A02922014), Республика Корея.
Materials
| GAMBORG B5 MEDIUM INCLUDING VITAMINS | Duchefa Biochemie | G0210.0050 | |
| SUCROSE | Duchefa Biochemie | S0809.5000 | |
| MES MONOHYDRATE | Duchefa Biochemie | M1503.0250 | |
| Agar, powder | JUNSEI | 24440S1201 | |
| Micropore Surgical tape | 3M | 1530-0 | |
| Surgical blade stainless No.10 | FEATHER | Unavailable | |
| Conical Tube, 50ml | SPL LIFE SCIENCES | 50050 | |
| Macerozyme R-10 | YAKULT PHARMACEUTICAL IND. | Unavailable | |
| Cellulase ONOZUKA R-10 | YAKULT PHARMACEUTICAL IND. | Unavailable | |
| ALBUMIN, BOVINE (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| D-Mannitol | SIGMA | M1902-1KG | |
| CALCIUM CHLORIDE, DIHYDRATE | MP BIOMEDICALS | 0219463505-5KG | |
| Twister | VISION SCIENTIFIC | VS-96TW | |
| Screen cup for CD-1 | SIGMA | S1145 | |
| Screens for CD-1 | SIGMA | S3895 | |
| Petri Dish | SPL LIFE SCIENCES | 10090 | |
| Pasteur pipette | HILGENBERG | 3150102 | |
| LABORATORY CENTRIFUGE / BENCH-TOP | VISION SCIENTIFIC | VS-5500N | |
| Sodium chloride | JUNSEI | 19015S0350 | |
| Potassium chloride | SIGMA | P3911-1KG | |
| D-GLUCOSE, ANHYDROUS | BIO BASIC | GB0219 | |
| Potassium Hydroxide | DUKSAN | 40 | |
| Calcium nitrate tetrahydrate | SIGMA | C2786-500G | |
| Poly(ethylene glycol) | SIGMA | P2139-2KG | |
| Magnesium chloride hexahydrate | SIGMA | M2393-500G | |
| Tube 13ml, 100x16mm, PP | SARSTEDT | 55.515 | |
| Microscope slides | MARIENFELD | 1000412 | |
| Microscope Cover Glasses | MARIENFELD | 101030 | |
| Counting Chamber | MARIENFELD | 650030 | |
| Axioplan 2 Imaging Microscope | Carl Zeiss | Unavailable | |
| Micro tube 1.5ml | SARSTEDT | 72.690.001 | |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA | M3148-250ML | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Proteomics Grade | VWR | M107-500G | |
| TRIS, Ultra Pure Grade | VWR | 0497-5KG | |
| DTT (DL-Dithiothreitol), Biotechnology Grade | VWR | 0281-25G | |
| Bromophenol blue sodium salt ACS | VWR | 0312-50G | |
| Glycerol | JUNSEI | 27210S0350 | |
| Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) | TAKARA | 632381 |
References
- Jarvis, P., Lopez-Juez, E. Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).
- Neuhaus, H. E., Emes, M. J. Nonphotosynthetic Metabolism in Plastids. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 51, 111-140 (2000).
- Rolland, N., et al. The biosynthetic capacities of the plastids and integration between cytoplasmic and chloroplast processes. Annual Review of Genetics. 46, 233-264 (2012).
- Jarvis, P. Targeting of nucleus-encoded proteins to chloroplasts in plants. New Phytologist. 179 (2), 257-285 (2008).
- Li, H. M., Chiu, C. C. Protein Transport into Chloroplasts. Annual Review of Plant Biology. 61, 157-180 (2010).
- Keegstra, K., Cline, K. Protein import and routing systems of chloroplasts. Plant Cell. 11 (4), 557-570 (1999).
- Gasser, S. M., Daum, G., Schatz, G. Import of proteins into mitochondria. Energy-dependent uptake of precursors by isolated mitochondria. Journal of Biological Chemistry. 257 (21), 13034-13041 (1982).
- Smeekens, S., Bauerle, C., Hageman, J., Keegstra, K., Weisbeek, P. The role of the transit peptide in the routing of precursors toward different chloroplast compartments. Cell. 46 (3), 365-375 (1986).
- Lee, D. W., et al. Arabidopsis nuclear-encoded plastid transit peptides contain multiple sequence subgroups with distinctive chloroplast-targeting sequence motifs. Plant Cell. 20 (6), 1603-1622 (2008).
- Lee, S., et al. Mitochondrial targeting of the Arabidopsis F1-ATPase gamma-subunit via multiple compensatory and synergistic presequence motifs. Plant Cell. 24 (12), 5037-5057 (2012).
- Jin, J. B., et al. A new dynamin-like protein, ADL6, is involved in trafficking from the trans-Golgi network to the central vacuole in Arabidopsis. Plant Cell. 13 (7), 1511-1526 (2001).
- Lee, K. H., Kim, D. H., Lee, S. W., Kim, Z. H., Hwang, I. In vivo import experiments in protoplasts reveal the importance of the overall context but not specific amino acid residues of the transit peptide during import into chloroplasts. Molecules and Cells. 14 (3), 388-397 (2002).
- Lee, D. W., Lee, S., Oh, Y. J., Hwang, I. Multiple sequence motifs in the rubisco small subunit transit peptide independently contribute to Toc159-dependent import of proteins into chloroplasts. Plant Physiology. 151 (1), 129-141 (2009).
- Lee, D. W., Woo, S., Geem, K. R., Hwang, I. Sequence motifs in transit peptides act as independent functional units and can be transferred to new sequence contexts. Plant Physiology. 169 (1), 471-484 (2015).
- Lee, J., et al. Both the hydrophobicity and a positively charged region flanking the C-terminal region of the transmembrane domain of signal-anchored proteins play critical roles in determining their targeting specificity to the endoplasmic reticulum or endosymbiotic organelles in Arabidopsis cells. Plant Cell. 23 (4), 1588-1607 (2011).
- Cleary, S. P., et al. Isolated plant mitochondria import chloroplast precursor proteins in vitro with the same efficiency as chloroplasts. Journal of Biological Chemistry. 277 (7), 5562-5569 (2002).
