リネージュの赤芽球系前駆細胞に成体マウス線維芽細胞のリプログラミングを直接します。
Summary
ここで紹介は私達のプロトコルによる生産の赤芽球系前駆細胞 (投資事業組合) 転写因子駆動を用いたマウス アダルト繊維芽細胞からダイレクトリプログラミング系統 (DLR)。
Abstract
赤芽球系細胞と分化細胞の運命を決定する、要因の成熟のグループによって仕組まれた血統制限の転写ネットワークの活性化を続行します。以前誘導赤芽球前駆細胞/前駆体 (投資事業組合) に線維芽細胞のプログラムし直す直接系統を使用した赤血球の開発を指示するために必要な要因の最小限のセットを定義に着手しました。Gata1、過剰発現を示したTal1、 Lmo2、およびC-myc (GTLM) が急速に変換マウスおよびひと線維芽細胞直接投資事業組合形態の観点から善意の赤芽球系細胞のように表現型、遺伝子発現。組合が赤血球や細胞の運命制御を研究する非常に貴重なツールを提供する予定です。ここで我々 は投資事業組合経由で転写因子駆動直接系統 (DLR) のリプログラミングにマウス尾先端線維芽細胞を変換する段階的なプロセスをについて説明します。この例では赤芽球系細胞の可視化を有効にする、エリスロポエチン受容体遺伝子 (EpoR) プロモーターの制御下の黄色い蛍光蛋白質 (YFP) を表す赤血球系統トレース マウス線維芽細胞のリプログラミングを行う運命誘導リプログラミングに。このプロトコルでは、次は、この線維芽細胞を 5 ~ 8 日以内投資事業組合に書き換えることができます。
改善はプロセスにまだ行うことができます、ことを示すリプログラミング GTLM を介した迅速かつ直接プロセスbona fideのプロパティを持つセルの赤芽球系前駆細胞および前駆細胞を降伏します。
Introduction
赤い血球 (赤血球) はすべての脊椎動物に欠かせない、人間の体の1のすべてのセルの 84% を占めています。胚は大人の生活に、私たちの健康は RBC の恒常性の厳密な規則に依存です。大人になって開発全体を通して成熟した赤血球の継続的な生産は、赤血球と呼ばれます。赤血球の研究の主要な課題は、RBC 開発とプリミティブと決定的な赤血球間のスイッチの組み合わせによって、マスターのレギュレータを定義することです。直接系統の赤芽球系前駆細胞のリプログラミング赤芽球開発の生体をさらに理解する機会を示します。
直接系統のリプログラミング、分化転換としても知られている (DLR) は、リプログラミング多能性細胞と多能性前駆段階をバイパスして、別に直接 1 つの細胞型のプロセスです。DLR はこれまで神経2、造血3,4、5、肝6ネフローゼ7、前駆細胞など様々 な細胞タイプを生成する使用されています。発達生物学者の DLR の分化系列決定と分化プロセス8,9尋問側面の重要なツールとなっています。DLR を補完して生体内で研究開発中の要因を決定する細胞の運命のメカニズムの理解を部分的に交換できます。このペーパーで説明した赤芽球前駆細胞をリプログラミングの DLR プロトコルは、赤血球の発達的研究の無料メソッド フィールドを提供します。
我々 は以前 4 因子カクテルの過剰発現、 GATA1、 TAL1、 LMO2、 C-MYC (GTLM)、誘導の赤芽球系前駆細胞に直接マウスおよびひと線維芽細胞をプログラムし直すため十分であることを示しています。(投資事業組合)10.、GTLM 書き換え赤芽球系細胞大きく似ているbona fide原始赤血球前駆細胞の形態、表現型、遺伝子の表現のための10の面で。こうして組合は増殖能力を限定し、有核赤血球無核赤血球造血の発症前に初期胚における一過性作り出されるそれらのように成熟しました。リプログラミングの条件 (例えば、点突然変異の要因やその他の要因の追加をプログラムし直す) に変更して、どのようにこれは赤芽球発生と分化の変化につながる理解できます。たとえば示しました GTLM カクテルKlf1またはMybの添加が主に胚 (プリミティブ) からグロビン表現パターンを変更主に大人に (明確な)。この発見は、赤血球産生の発達的要因を定義するためのツールとして DLR を使用の妥当性を裏付けます。
ここでは、我々 は、マウス尾先端繊維芽細胞 (TTF) から組合を生成するプロセスを概説します。赤血球系統トレース マウス線維芽細胞のリプログラミングを行った代表的な実績 (EporCre R26– eYFP) すべてのRosa26軌跡から黄色い蛍光蛋白質 (eYFP) を表現するセル赤血球系統へのコミットメントを簡単に表示できるように、エリスロポエチンの受容体を表明しています。このメソッドを使用して、YFP 正 (EpoR +) 細胞が存在、早ければ 5 日伝達後です。このプロトコルは、したがって、赤芽球系前駆細胞の in vitroの世代の迅速かつ信頼性の高い技術を提供しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
4 因子カクテルの過剰発現、 GATA1、 TAL1、 LMO2、 C-MYC (GTLM)、組合10に直接マウスおよびひと線維芽細胞をプログラムし直すための十分なです。プログラムし直された赤芽球系細胞には、 bona fide赤血球前駆細胞の形態、表現型、遺伝子発現及びコロニー形成能の面で大きく類似していた。こ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
レトロ ウイルス ライブラリを生成するために使用するプラスミドの多くを提供するクローニングとハーヴェイ Lodish (ホワイト ヘッド研究所)、イブ王とグレゴリー ・ ハイド (ホワイト ヘッド研究所、ケンブリッジ、MA) に感謝します。IEP 生産の説明での役割、Kavitha シヴァとソフィー Singbrant (分子医学、遺伝子治療、ルンド大学)、ヨーラン カールソンと Shamit Soneji (分子血液学の部門、ルンド大学) に感謝します。認め、ジュリアン ・ Pulecio (再生医療センター、バルセロナ医研究公園)、ビオレッタ レーヨン エストラーダ (ロックフェラー大学、ニューヨーク)、カール ・ スタッフ ・感謝も申し上げます (セント ・ ヴィンセント ・医学研究所とセントヴィンセントの病院、メルボルン大学の部門)、スペイン ・ ラヤ (研究や高度な研究、バルセロナのカタロニア語機関) とビジェイ G. Sankaran (ブロード研究所の技術とハーバード、ケンブリッジのマサチューセッツ大学) この作品へ以前の貢献。この作品は、(j. f.); にラグナル協会財団によって支えられました。スウェーデン研究評議会 (に j. f.)。Stiftelsen オルレ Engkvist Byggmästare (に j. f.)。スウェーデン (j. f.); に戦略的研究財団Åke ウヰーベルグ財団 (に j. f.)。(j. f.) に助成金統合マリー キュリー。
Materials
| DMEM without sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30022.01 | Culturing media for PhGP cells |
| DMEM with sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30243.01 | Culturing media for tail tip fibroblasts |
| StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM) | Stem Cell Technologies | 9650 | Reprogramming media |
| Fetal Bovine Serum HyClone | GE Life Sciences | SH30071.03HI | Growth factor |
| Penicillin/Streptomycin HyClone (100x) | Ge Life Sciences | SV30010 | Antiboiotic |
| Non-Essential Amino Acids (100x) | Thermo Fisher | 11140050 | SNL media is suppplemented with this |
| Trypsin HyClone (1x) | GE Life Sciences | SH30042.01 | Cell dissociation agent |
| Murine Stem Cell Factor (mSCF) | Peprotech | 250-03 | Added to reprogramming media |
| Recombinant Murine Il-3 | Peprotech | 213-13 | Added to reprogramming media |
| human recombinant erythropoietin (hrEPO) | Peprotech | 100-64 | Added to reprogramming media |
| Dexamethasone | Sigma | 50-02-2 | Added to reprogramming media |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | 9000-70-8 | Dissovled in dH2O and used for coating plates. Ensure sterility before use. |
| Blasticidin S hydrochloride | Sigma | 3/9/3513 | Selection antibiotic. Affects both pro- and eukaryotic cells |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Ge Life Sciences | SH30850.03 | Used for washing steps |
| Polybrene | Merck | TR-1003-G | Infection / Transfection Reagent |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | Transfection Reagent for PhGP cell line |
| Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm | Merck | SLGP033RS | Used for filtering virus supernatant |
| BD Emerald Hypodermic Syringe | Becton Dickinson | SKU: 307736 | Used for filtering virus supernatant |
| 100 mm Culture Dish | Corning | 430167 | Cell culture |
| 6-well plate | Falcon | 10799541 | Cell culture |
| Jeweler Forceps #5 | Sklar | 66-7642 | Used for handling small tail fragments |
| Sklarlite Iris Scissors | Sklar | 23-1149 | Used for cutting the tail into small pieces |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures |
| CD117 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-091-224 | For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures |
| PheonixGP cells | ATCC | CRL-3215 | retroviral packaging cell line |
| EcoPAC vector (pCL-Eco) | Novus Biologicals | NBP2-29540 | retroviral helper vector containing gag and pol genes |
| pMX-Gata1 | Cloned in-lab | ||
| pMX-Tal1 | Cloned in-lab | ||
| pMX-Lmo2 | Cloned in-lab | ||
| pMX-cMyc | Cloned in-lab | ||
| CellSens Standard 1.6 software | Cytospin analysis software |
References
- Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. Are We Really Vastly Outnumbered? Revisiting the Ratio of Bacterial to Host Cells in Humans. Cell. 164 (3), 337-340 (2016).
- Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2527-2532 (2012).
- Szabo, E., et al. Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors. Nature. 468 (7323), 521-526 (2010).
- Pereira, C. F., et al. Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts. Cell Stem Cell. 13 (2), 205-218 (2013).
- Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells. Cell Reports. 9 (5), 1871-1884 (2014).
- Yu, B., et al. Reprogramming fibroblasts into bipotential hepatic stem cells by defined factors. Cell Stem Cell. 13 (3), 328-340 (2013).
- Hendry, C. E., et al. Direct transcriptional reprogramming of adult cells to embryonic nephron progenitors. Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1424-1434 (2013).
- Vierbuchen, T., Wernig, M. Direct lineage conversions: unnatural but useful. Nature Biotechnology. 29 (10), 892-907 (2011).
- Capellera-Garcia, S., Flygare, J. Direct lineage reprogramming: a useful addition to the blood cell research toolbox. Expert Review of Hematology. 10 (2), 107-109 (2017).
- Capellera-Garcia, S., et al. Defining the Minimal Factors Required for Erythropoiesis through Direct Lineage Conversion. Cell Reports. 15 (11), 2550-2562 (2016).
- Mahmoudi, S., Brunet, A. Aging and reprogramming: a two-way street. Current Opinions in Cellular Biology. 24 (6), 744-756 (2012).
- Singbrant, S., et al. Erythropoietin couples erythropoiesis, B-lymphopoiesis, and bone homeostasis within the bone marrow microenvironment. Blood. 117 (21), 5631-5642 (2011).
- Heinrich, A. C., Pelanda, R., Klingmuller, U. A mouse model for visualization and conditional mutations in the erythroid lineage. Blood. 104 (3), 659-666 (2004).
- Gautier, E. L., et al. Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages. Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).
- Psaila, B., et al. Single-cell profiling of human megakaryocyte-erythroid progenitors identifies distinct megakaryocyte and erythroid differentiation pathways. Genome Biology. 17 (1), 83 (2016).
- Pulecio, J., et al. Direct Conversion of Fibroblasts to Megakaryocyte Progenitors. Cell Reports. 17 (3), 671-683 (2016).
- Kurita, R., et al. Establishment of immortalized human erythroid progenitor cell lines able to produce enucleated red blood cells. PLoS One. 8 (3), 59890 (2013).
