Drosophila görsel sistem düşük bol hücrelerinin arıtma
Summary
Burada, verimli bir şekilde hücreleri mevcut Drosophila görsel sistemi aktif floresans hücreye (FACS) sıralama içinde düşük bereket, izole bir hücre ayrılma protokol mevcut.
Abstract
Sonraki nesil sıralama son ilerleme duyarlılık içinde az sayıda hücre transcriptomic ve genomik analizler uygulamaya kolaylaştırdı. Kullanmak bu teknoloji geliştirme hücre türüne özgü genetik araçları zenginliği sahip, Drosophila görsel sistemde, eğitim için güçlü bir yaklaşım geliştirme ile kesin hücresel kararlılık moleküler temeli adresleme için sağlar. Uygulanabilir böyle bir yaklaşım için güvenilir ve verimli bir şekilde mevcut düşük bolluk içinde beyin hücreleri arındırmak için kapasitesine sahip önemlidir. Burada, verimli arıtma tek hücre klonlar genetik mozaik deneylerde sağlayan bir yöntem mevcut. Floresans kullanarak arıtma (FACS) (~ %25 tüm etiketli hücreleri) sıralama hücre aktif ve transcriptomics analizler aracılığıyla oluşturulan tek hücre klonlar başarıyla gerçekleştirilen sonra bu iletişim kuralı ile sürekli yüksek hücresel verim elde ettik Mozaik analizi ile bir repressible Hücre işaretçisi (MARCM). Bu iletişim kuralı, transcriptomic ve genomik analizleri belirli hücre tipleri için visual sisteminde farklı aşamalarında gelişme ve farklı genetik manipülasyon bağlamında genelinde uygulamak için idealdir.
Introduction
Drosophila görsel sistem geliştirme ve davranış genetik temeli çalışmak için olağanüstü bir modeldir. Kalıplaşmış hücresel mimarisi1 ve belirli hücre türleri2,3değiştirmek için gelişmiş bir genetik toolkit oluşmaktadır. Bu sistemin büyük bir güç özerk hücre tipleri ile tek hücre kararlılık, genetik mozaik yöntemleri4,5kullanarak ilgi işlevinde gen sorguya çekmek için yeteneğidir. Hücre türüne özgü transcriptomic gerçekleştirmek için sonraki nesil sıralama son gelişmeler ile bu genetik araçlarını birleştirmek aranan ve tek hücredeki genomik analizleri klonlar genetik mozaik deneyler.
Bunu yapmak için seçime bağlı olarak beyindeki düşük bol hücre popülasyonlarının yalıtmak için sağlam ve verimli bir yöntem geliştirmek için önemlidir. Daha önce biz FACS aracılığıyla pupa geliştirme sırasında visual sisteminde belirli hücre tipleri yalıtma ve RNA-seq6kullanarak kendi transcriptomes belirlemek için bir iletişim kuralı geliştirilmiştir. Bu deneylerde hücreleri (Örneğin R7 photoreceptors) belirli bir türdeki büyük çoğunluğu fluorescently etiketli. Neyin yalnızca bir alt kümesini aynı türden hücreleri etiketlenir, genetik mozaik deneylerde bu yöntemle kaliteli sıralama verileri elde etmek için yeterince hücre izole etmek başarısız oldu. Bu sorunu çözmek için hücre ayrılma Protokolü geliştirerek hücresel verim artışı istedi.
Yaklaşımımız Disosiye hücrelerin sağlığını en üst düzeye çıkarmak, diseksiyon ve ayrılma arabellekleri değiştirerek hücresel sağlığı geliştirmek için protokol toplam uzunluğu azaltmak ve mekanik bozulma disseke doku miktarını azaltmak için yapıldı. Biz fluorescently klonlar vahşi yazın veya mutant gen ilgi için belirli hücre tiplerinin, etiketli tek nesil sağlayan bir repressible Hücre işaretçisi ile5 (MARCM), mozaik analizi kullanılarak geliştirilmiş protokol7 test bir Aksi takdirde Heterozigoz sinek. Nerede aynı koşullar altında bizim önceki Protokolü RNA-seq için yeterli malzeme oluşturulamadı, geliştirilmiş protokolü başarılı olmuştur. Tekrarlanarak yüksek hücresel verim (~ % 25 etiketli hücre) elde etmek ve kaliteli RNA-seq verileri kadar az 1.000 hücrelerin7‘ den elde.
Bir dizi protokolü daha önce belirli hücre tipleri Drosophila6,8,9,10,11,12,13 ‘ te yalıtmak için tarif var , 14 , 15 , 16. bu protokol çoğunlukla beyin içinde bol olan hücreler yalıtmak için tasarlanmıştır. Bizim iletişim kuralı FACS sonraki transcriptomic ve genomik analizleri için kullanarak görsel sisteminde düşük bol hücre popülasyonlarının (100’den az beyin hücreleri) yalıtmak için optimize edilmiştir. Bu iletişim kuralı ile biz tekrarlanarak düşük bol hücreler FACS ve RNA-seq. tarafından yüksek kaliteli transcriptome veri alma tarafından sinek görsel sisteminden yalıtmak için bir yol sağlamak amacı
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu iletişim kuralı basit ve yürütmek Teknik olarak zor değil, ama orada birkaç anahtar adımlar bu gözden eğer hücresel verim içinde önemli ölçüde azalmasına neden. (Adım 2.3.2.) Bu haçlar sağlıklı ve gıda kurumasına da önemlidir. Düzenli sulama haçlar doğru genotip ve doğru geliştirme aşamasında olan sinekler diseksiyon için kullanılabilir sayısını en üst düzeye çıkarmak için gerekli olduğunu. Ne sıklıkta haçlar sulanması gerek kullanılan gıda ve barınma koşulları “Sinek…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma Ulusal Sağlık Enstitüleri Ödülü numarası K01NS094545, nörodejeneratif hastalıklar çalışma Lefler Merkezi’nden andgrants altında NINDS tarafından finanse edildi. Değerli görüşmeleri için Liming Tan ve Jason McEwan kabul edersiniz.
Materials
| Liberase TM | Roche | 5401127001 | Proteolytic enzyme blend |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G0350500 | |
| L-Glutathione | Sigma-Aldrich | G6013 | |
| Heat Inactivated Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Insulin Solution | Sigma-Aldrich | I0516 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Sigma-Aldrich | P4458 | |
| Schneider's Culture Medium | Gibco | 21720024 | |
| Papain | Worthington | LK003178 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA purification kit |
| RNase-free DNase | Qiagen | 79254 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18064-014 | |
| dNTP Mix | Life Technologies | R0191 | |
| MgCl2 Solution | Sigma-Aldrich | M1028-10X1ML | |
| Betaine Solution | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
| RNaseOUT | Life Technologies | 10777-019 | |
| Q5 High-Fidelity 2x Master Mix | New England Biolabs | M0492S | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| Nextera XT DNA Library Prepration Kit | Illumina | FC-131-1024 | |
| Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | |
| Test Tube with Cell Strainer Snap Cap | Falcon | 352235 | |
| Bottle-Top Vacuum Filter Systems | Corning | CLS431153 | |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000020 | |
| FACSAria Flow Cytometer | BD Biosciences | 656700 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY–401–2501 |
References
- Fischbach, K. -. F., Dittrich, A. P. M. The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure. Cell and Tissue Research. 258, 441-475 (1989).
- Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (28), 9715-9720 (2008).
- Jenett, A., et al. A GAL4-driver line resource for Drosophila neurobiology. Cell Rep. 2 (4), 991-1001 (2012).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Tan, L., et al. Ig Superfamily ligand and receptor pairs expressed in synaptic partners in drosophila. Cell. 163 (7), 1756-1769 (2015).
- Peng, J., et al. Drosophila Fezf coordinates laminar-specific connectivity through cell-intrinsic and cell-extrinsic mechanisms. Elife. 7, (2018).
- Krasnow, M. A., Cumberledge, S., Manning, G., Herzenberg, L. A., Nolan, G. P. Whole animal cell sorting of Drosophila embryos. Science. 251 (4989), 81-85 (1991).
- Cumberledge, S., Krasnow, M. A. Preparation and analysis of pure cell populations from Drosophila. Methods in Cell Biology. 44, 143-159 (1994).
- Bryant, Z., et al. Characterization of differentially expressed genes in purified Drosophila follicle cells: toward a general strategy for cell type-specific developmental analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (10), 5559-5564 (1999).
- Neufeld, T. P., de la Cruz, A. F., Johnston, L. A., Edgar, B. A. Coordination of growth and cell division in the Drosophila wing. Cell. 93 (7), 1183-1193 (1998).
- Calvi, B. R., Lilly, M. A. Fluorescent BrdU labeling and nuclear flow sorting of the Drosophila ovary. Methods in Molecular Biology. , 203-213 (2004).
- Tirouvanziam, R., Davidson, C. J., Lipsick, J. S., Herzenberg, L. A. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) of Drosophila hemocytes reveals important functional similarities to mammalian leukocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (9), 2912-2917 (2004).
- Bryantsev, A. L., Cripps, R. M. Purification of cardiac cells from Drosophila embryos. Methods. 56 (1), 44-49 (2012).
- Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing. Nature Protocols. 8 (6), 1088-1099 (2013).
- Khan, S. J., Abidi, S. N., Tian, Y., Skinner, A., Smith-Bolton, R. K. A rapid, gentle and scalable method for dissociation and fluorescent sorting of imaginal disc cells for mRNA sequencing. Fly (Austin). 10 (2), 73-80 (2016).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
- Nern, A., Zhu, Y., Zipursky, S. L. Local N-cadherin interactions mediate distinct steps in the targeting of lamina neurons. Neuron. 58 (1), 34-41 (2008).
