Onlar yaşayan hücrelerden salgılanan gibi biz tek etiketlenmemiş proteinler gerçek zamanlı Optik algılama için bir iletişim kuralı mevcut. Bu çeşitli farklı biyolojik sistemleri ve yapılandırmaları için uygulanabilir dalgaboyu saçılma (iSCAT) mikroskopi dayanmaktadır.
Dalgaboyu saçılma (iSCAT) mikroskopi, gerçek zamanlı olarak bireysel yaşayan hücrelerden salgılanan tek etiketlenmemiş proteinler algılama yeteneğine sahip bir yöntemi göstermektedir. Bu protokol için biz bir iSCAT mikroskobu gerçekleştirmek ve bir hücre altında eğitim canlılığı izlemek için ek görüntüleme kanalları ile tamamlayıcı için temel adımları kapsar. Onlar biz bir ölümsüzleştirdi B-hücre hattı (Laz388) ile göstermek bir canlı hücreden salgılanan gibi bu, biz tek proteinlerin gerçek zamanlı algılama yöntemini kullanın. Mikroskop ve örnek hazırlanması yanı sıra kaydedilen verilerin analizi ile ilgili gerekli adımları ele alınmıştır. Video iletişim kuralı o iSCAT mikroskobu salgı tek molekül düzeyinde eğitim için basit bir yöntem sunmaktadır gösterir.
Salgılanan proteinler çeşitli fizyolojik süreçleri1içinde önemli bir rol oynamaktadır. Bu nedenle, onlar düzenli olarak toplu ensemble (proteomik) veya tek bir varlık2,3olarak incelenmektedir. Proteomik geleneksel olarak proteinler Örneğin, enzim bağlı immunosorbent deneyleri (ELISA), akış sitometresi veya kütle spektrometresi4,5yoluyla belirli bir biyolojik sistemi mevcut kümesinin tamamını inceler, 6. Tek proteinler, öte yandan, genellikle çeşitli floresan7,8, plasmonics9,10veya kriyojenik elektron11 temel teknikler kullanarak algılanır microscopies. Tüm bu tekniklerin karmaşık aletler, etiketleme veya her ikisini kullanmak ve onlar sadece altında eğitim sistemi hakkında uzun vadeli bilgi teslim gibi genellikle dynamics bilgi eksikliği.
Burada alt ikinci zamansal çözünürlük14ile iSCAT12,13 mikroskobu anlamda bireysel salgı proteinler için kullanırız. Önemlisi, bu teknik zayıf dağınık sinyal her protein12,14‘ e içsel algılar. Küçük bir bioparticle scatters ışık miktarını onun polarizability ile ölçekler. Bir proteinin şekil farklı bir etkili saçılma küre14,15,16ve bunu yaklaşık varsayarak proteinler çok benzer Kırılma endeksi var, ölçülen sinyali doğrudan olabilir Moleküler Ağırlık (MW) protein bağlı. İSCAT kontrast karşı moleküler ağırlığa göre başvuru ölçümleri ampirik kalibrasyonu bir proteinler farklı boyutlarda ayırt etmek izin verir. iSCAT deneyler kolayca floresans mikroskobu17,18, immunosorbent reaktifler yanı sıra herhangi bir protein faiz14 özel bir algılama için izin vermek için floresan veya saçılmasını etiketleri tarafından tamamlanmaktadır , 17 , 19.
Prensip olarak, protein zayıf dağınık ışık dalgaboyu ikincil başvuru dalga ile karıştırma yoluyla yükseltecek tarafından iSCAT çalışır. Algılanan yoğunluğu () bir iSCAT içinde mikroskop tarafından anlatılan
nerede olay yoğunluğu,
bir katsayısı referans dalga katkı için
nano nesnenin altında eğitim, saçılma gücünü belirtir ve
faz kayması arasında dağınık olduğunu ve başvuru dalgalar14. Ya iletilen veya geri yansıyan olay ışık genellikle her durumda nerede bir referans dalga kullanılan
transmissivity veya yansıtma örnek odası için sırasıyla hesapları. Dönem
protein çapraz bölüm saçılma için orantılıdır ve çapraz bir süre için karşılaştırıldığında ihmal. Böylece, ayarı
tam yıkıcı girişim için algılanan ışık tarafından verilen
nerede
başvuru yoğunluğu ve
parazit yoğunluğu.
iSCAT mikroskobu biyolojik süreçlerin tek molekül düzeyinde eğitim için mükemmel bir yöntem sunmaktadır. Örnek olarak, biz Laz388 hücreleri araştırmak — bir Epstein – Barr virüsü (EBV) B lenfosit hücre satır20,21 dönüştürülmüş — onlar IgG antikorlar16gibi proteinler salgılar gibi. Ancak, yöntem genel ve çeşitli diğer biyolojik sistemleri için uygulanabilir. iSCAT doğal olarak belirsiz ve herhangi bir protein-ebilmek bulmak veya nanopartikül veya bu belirli veya çoğaltılmış algılama için ortak yüzey functionalization yöntemleri ile genişletilebilir. Sadeliği ve floresan mikroskopisi gibi görme duyusuyla ilgili diğer teknikleri ile kombine edilebilir yeteneği iSCAT hücre biyolojisi içinde değerli bir tamamlayıcı araç olun.
Yararlı iSCAT veri alma için en önemli yönleri biridir yeteneği doğru odak konumuna coverslip yüzeyde ve, Ayrıca, için bulmak için uzun bir süre için bu konumu koruyun. Bunu yapmak başarısız genişletilerek PSFs, zayıf iSCAT sinyalleri ve drift ilişkilendirilmiş yapıların dynamics analizlerde neden olur. Yüzey özellikleri büyük referans ışını arka planı görünür değildir olarak odak düzlemi üzerinde temiz, çıplak coverslip bulma yüzey kolay bir iş olmadığını ortaya çıktı (bkz. Şekil 4 d).
Ham iSCAT görüntüleri kez wavefront kirleri uyarma kaynak kaynaklanan ve doğru görüntüleme uçak bulmak için bir yetenek engel olabilir arka plan sinyalleri tarafından kapatmamasını. Etkin wavefront çıkarma bu sorunu aşmak ve daha sonra sırasında bir ölçüm16iSCAT odak izlemek için kullanışlı bir yoldur. Bunu gerçekleştirmek için bir kayma örnek modülasyon yoludur. Kısacası, bir işlev üreteci bir kayma örnek modülasyon (290 nm genlik) uygulanan frekansta sonuçlanan piezo sahne alanı’nın dış denetim noktasına 50 Hz kare dalga geçerlidir. Zaman uyumlu kamera satın almalar aynı kaynaktan, kilit-in ilkeleri, sonuç wavefront telafi görüntü14,16ile bir araya geldiğinde tetiklenir. Ortaya çıkan görüntü genellikle coverslip (Şekil 4e) yüzey pürüzlülüğü gösterir. Cama temizlendikten sonra kalan küçük özellikler mikroskop odak haline getirmek için kullanılabilir. Bu etkin arka plan çıkarma adım için kullanılan parametreler kare hızı, pozlama süresi veya donanım göre değiştirilebilir.
Yukarıda belirtildiği gibi bir yüksek kaliteli ışın ayırıcı iSCAT kurulum (adım 1.2.1.) kullanılması önerilir, hayalet gibi eserler Imaging olarak veya ince düzlemsel ışın kırma kaynaklanan parazit görüntüyü etkileyecektir ve ölçüm rahatsız. Şekil 7 bir yüksek kaliteli ve düşük kaliteli ışın ayırıcı arasında bir karşılaştırma gösterir. Her iki ham iSCAT görüntüler aynı bölgede kalan bazı parçacıkları içeren coverslip göstermektedir. Aynı iSCAT Kur hem görüntüleri yakalamak için kullanıldı, sadece ışın bölücü değiş tokuş. Şekil 7a gösterir kamerayı bir daha kalın (5 mm), kullanımı ile oluşan görüntü AR kaplı ve kamalı ışını splitter. Kamalı tasarımı sayesinde ışın bölücü arka yüzeyinden yansıyan ışın ön yüzeyinden kaynaklanan yansıma için anti-paralel ve amacı giriyor değil. Hiçbir girişim eserler meydana gelir. Şekil 7b aynı görüş alanı örnek üzerinde gösterir ama bu sefer bir daha ince (1 mm) düzlemsel ışın ayırıcı kullanıldı. Kiriş kırık, ön ve arka yüzeylerden yansımaları iki paralel ve fotoğraf makinesine aktarabilirsiniz. Girişim eserler açıkça görülebilir.
Şekil 7: karşılaştırma iSCAT görüntülerin üretilen yüksek ve düşük kaliteli ışın ayırıcılar ile. 5 mm kalınlığında, AR kaplı ve kamalı ışın ayırıcı kullanımı tarafından (a) Resulting ham iSCAT görüntü. (b) Resulting ham iSCAT görüntü bir 1 mm kalınlığında düzlemsel ışın ayırıcı kullanılarak aynı bölgede. Her iki kiriş kırık aynı bölme oranı (% 50 yansıma, % 50 iletim) vardır. Fresnel Yansımalar gelen doğan girişim eserler açıkça 1 mm kalınlığında düzlemsel ışın splitter ile üretilen resimdeki gözlenir. Ölçek çubukları: 2 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Bu protokol için o hızlı, kolay gerçekleştirmek ve paralel üzerinde geniş bir alan14algılama için sağlar gibi bir geniş-alan aydınlatma düzeni iSCAT için tarif. Başka bir ortak yaklaşım acousto-optik yansıtıcılar (AODs) kullanın ve örnek12,17confocal bir ışın tarama etmektir. Bu yaklaşım yüksek kaliteli wavefronts engeller ancak daha deneysel olarak geleneksel geniş alanlı görüntüleme daha karmaşıktır. Ayrıca, confocal aydınlatma hız bu AODs tarafından sınırlıdır. İstenen deneysel parametreleri bağlı olarak, ya confocal ya da geniş alanlı aydınlatma düzenleri prensip olarak, canlı hücrelerden salgılanan tek proteinler algılamak için yararlı olabilir.
Boyunca protokolünün anlatıldığı gibi bu örnek sahne yanal mekanik dalgalanmalar mikroskop en aza indirmek için zorunludur. Örnek konumunu bile sapmalar nanometre ardışık kamera çerçeveler farklılığı neden ve önemli yabancı gürültü fark resimdeki teşvik. Bu nedenle bir mekanik olarak istikrarlı mikroskop sahne ve damped optik tablo (adım 1.1.1.) kullanmak için ve optik perde veya paneller ile kurulum (adım 3.5.) bir deney sırasında karşılamak için önerilir.
Bir odağın istikrar düzeni de uzun vadeli ölçülerini düşünülebilir. Bu yaklaşım, ikinci bir lazer bir toplam iç yansıma (tır) düzenlemesi mikroskop dahil ve daha sonra bir çeyreği fotodiyot yansıması. Değişiklikler sistemin odak tır lazer sonra etkin bir geribesleme piezo sahne26z ekseni kontrol için kullanılan çeyrekte diyot, spot yanal talebiyle çevirmek. Uzun vadeli dikey drift etkileri böylece ortadan kalkar.
Birkaç değişiklik ve uzantılarını adresi ihtiyaçlarınıza deneysel sunulan tekniği uygulanır. Örneğin, ticari mikroskop sahne İnkübatörler kullanılabilir Bu kolayca dahil iSCAT mikroskop için uzun vadeli düşsel hücre içine. Diğer teknikleri de iSCAT gibi görüntüleme tamamlayacak uygulanabilir confocal veya tır floresan microscopies17. Lazer ışığı emme nedeniyle deneme rahatsız edemez altında eğitim, iSCAT salgılanması ölçümleri DMEM veya DPBS, gibi diğer hücre ortamlarda yürütülen olabilir sistemdeki adapte ancak, pH göstergesi fenol red kaçınılmalıdır. Ek olarak, fetal buzağı serum (FCS) veya insan trombosit lysate (hPL) gibi takviyeleri iSCAT algılama ile girişime neden olabilir proteinler bulunur. Deneme istenen duyarlılık bağlı olarak, bu takviyeleri mikroskobu ortamından dışlanmaları gerekir.
iSCAT dağılım ışık bir analit’ın yeteneğini kullanır — tüm proteinler için içsel bir özellik — ve bu nedenle doğal olarak belirsiz. Yine de, özgüllük bir dereceye iSCAT sinyalleri ölçek protein kitle14,27,28ile doğrusal olarak mümkündür. Bu standart protein örnekleri, Sığır serum albumin (BSA) ve fibrinojen14,27,28gibi kullanarak bir iSCAT sisteminin kalibrasyon için sağlar. Gerçek şu ki, çok yakın zamanda, Genç vd. 28 Piliarik & Sandoghdar14 çalışmalarına genişletmiştir ve o iSCAT proteinler streptavidin (53 kDa) küçük molekül ağırlığı kitle çözünürlüğe sahip 19 kDa ve doğru olarak yaklaşık 5 kDa ile belirlemek için kullanılan göstermiştir. Birkaç geleneksel yaklaşım daha fazla özgüllük fazladan bir düzey sağlayarak iSCAT tamamlayıcı olabilir. Bir örnek, enzim bağlı immunosorbent deneyleri (ELISA) ve/veya diğer yüzey değişiklikleri kısıtlamak gibi olaylar böylece sadece hedef protein bağlayıcı protein16algıladı.
Bu protokol için nasıl iSCAT mikroskobu ile subsecond zamansal çözünürlük16tek protein düzeyinde hücresel salgıları araştırmak için kullanılabilir nitelendirdi. Teknik genel ve herhangi bir ticari veya ev yapımı mikroskobunun uygulanabilir. Tek molekül floresans yaklaşımlar, aksine yöntemi photobleaching acı değil veya etkiler, ancak bu yanıp sönen hala tek-protein hassasiyet elde eder. Bu özellikler iSCAT biosensing ve mikroskopi alanında güçlü bir araç olun. Gelecekteki uygulamalar uyarıcı veya hücresel iletişim immünolojik yanıt gibi karmaşık hücresel etkileşimlerin elucidating üzerinde durulacak.
The authors have nothing to disclose.
Bu eser Max Planck toplum, Alexander von Humboldt profesörlük ve Deutsche Forschungsgemeinschaft (CRC 1181) tarafından desteklenmiştir. Laz388 hücreler sağlamak için ve yararlı tartışmalar için Universitätsklinikum Erlangen Stefanie Schaffer teşekkür ederiz. Biz Simone Ihloff ve Maksim Schwab MPL teknik destek için teşekkür ederiz.
Item/Device | |||
100x / 1.46 NA objective | Zeiss | 420792-9800-000 | alpha Plan Apochromat oil immersion |
20x / 0.4 NA objective | Leica | 566049 | N Plan |
Piezo Stage | PI | P-517k020 | 3-axis stage with 100x100x10µm range |
Diode laser (445 nm) | Lasertack | PD-01236 | |
Optics/Optomechanics | Thorlabs/Newport | – | lenses, mirrors, posts, mounts |
Pinhole | Thorlabs | P30H | |
LED light source | Thorlabs | MCWHL5 | |
Shortpass filter (580 nm) | Omega Optical | 580SP | to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation |
Longpass filter (500 nm) | Thorlabs | FEL0500 | to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation |
70R/30T beam splitter | Newport | 20Q20BS.1 | |
Economy beam splitter | Thorlabs | EBS1 | used for the comparison of fringe effects |
Wedged plate beam splitter | Thorlabs | BSW26 | used for the comparison of fringe effects |
Shortpass dichroic mirror (550 nm) | Edmund Optics | 66249 | |
8R/92T beam splitter | Thorlabs | BP108 | |
CMOS camera | Photonfocus | MV1-D1024E-160-CL | for iSCAT aquisition |
CMOS cameras | Mightex | SCE-B013-U | for bright field / fluorescence aquisition |
Longpass filter (600 nm) | Thorlabs | FELH0600 | |
Computer | Fujitsu Siemens | – | Core i7 Processor, 16 GB RAM, SSD |
Acquisition Software | LabVIEW | – | LabVIEW 2016 Suite |
Analysis Software | Matlab | – | Matlab 2014 Suite |
Plasma Cleaner | Diener | Diener pico | |
Incubator | Binder | Model CB | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Reagent/Material | |||
RPMI 1640 medium | Gibco | 11835063 | without phenol red |
HEPES Buffer Solution (1M) | Sigma Aldrich | 59205C | |
Cover slides | Marienfeld | 107052 | |
Glass bottom culture dishes | ibidi | 81158 | |
Fluorescent Microspheres | Invitrogen | F8821 | used for calibration |
Immersol immersion oil | Zeiss | 444960 | |
Propidium iodide stain | Invitrogen | R37108 | |
Small pipette tips | Eppendorf | 30075005 | |
Flexible pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
Ethanol, 99.8% | Fisher Scientific | E/0650DF/15 | |
Sodium hydroxide, pellets | Sigma Aldrich | 221465 | for preparing 0.2M NaOH solution |