Wir präsentieren ein Protokoll für die Echtzeit-optische Erkennung von einzelnen unbeschriftete Proteine, wie sie von lebenden Zellen abgesondert werden. Grundlage hierfür ist interferometrischen Streuung (iSCAT) Mikroskopie, die auf eine Vielzahl von unterschiedlichen biologischen Systemen und Konfigurationen angewendet werden können.
Wir zeigen interferometrischen Streuung (iSCAT) Mikroskopie, eine Methode in der Lage, einzelne unbeschriftete Proteine aus einzelnen lebenden Zellen in Echtzeit abgesondert zu erkennen. In diesem Protokoll decken wir die grundlegenden Schritte, um eine iSCAT Mikroskop erkennen und ergänzen es mit zusätzlichen bildgebenden Sendern, die Lebensfähigkeit einer Zelle unter Studie zu überwachen. Im Anschluss daran verwenden wir die Methode für Echtzeit-Erkennung von einzelnen Proteinen, wie sie von einer lebenden Zelle abgesondert werden, die wir mit einem verewigt B-Zell-Linie (Laz388) zeigen. Notwendigen Schritte in Bezug auf die Vorbereitung des Mikroskops und Probe sowie die Analyse der aufgezeichneten Daten werden diskutiert. Das video Protokoll zeigt, dass iSCAT Mikroskopie bietet eine einfache Methode um Sekretion der Einzelmolekül-Ebene zu untersuchen.
Sekretierten Proteine spielen eine bedeutende Rolle in verschiedenen physiologischen Prozesse1. Aus diesem Grund werden sie routinemäßig als eine kollektive Ensemble (Proteomics) oder als einzelne Elemente2,3untersucht. Proteomics untersucht traditionell die Gesamtheit der Proteine in einem bestimmten biologischen System durch z. B. Enzym-linked Immunosorbentprobe Assays (ELISA), Durchflusszytometrie oder Massenspektrometrie4,5, 6. Einzelne Proteine, auf der anderen Seite, werden in der Regel erkannt mit einer Vielzahl von Techniken, die auf Fluoreszenz7,8, Plasmonik9,10oder kryogene Elektron11 Microscopies. Alle diese Techniken verwenden komplexe Instrumente, Kennzeichnung, oder beides und oft keine Dynamik Informationen, wie sie nur langfristige Informationen zum System unter Studie liefern.
Hier verwenden wir iSCAT12,13 Mikroskopie, Sinn einzelne Sekretorische Proteine mit unter einer Sekunde zeitlicher Auflösung14. Wichtig ist, erkennt die Technik der verstreuten schwach untrennbar mit jedem Protein12,14. Die Lichtmenge, die eine kleine Bioparticle streut skaliert mit der Polarisierbarkeit. Geht man davon aus, dass die Form eines Proteins durch eine effektive Streuung Kugel14,15,16, und dass verschiedene angenähert werden kann kann Proteine haben sehr ähnliche Brechungsindizes, das gemessene Signal direkt das Molekulargewicht (MW) des Proteins verbunden. Die empirischen Kalibrierung des iSCAT Kontrast im Vergleich zu Molekulargewicht von Referenzmessungen erlaubt es, Proteine in verschiedenen Größen zu unterscheiden. iSCAT Experimente können leicht durch Fluoreszenz-Mikroskopie17,18, Immunosorbentprobe Reagenzien sowie fluoreszierende oder Streuung Etiketten ermöglichen eine spezifische Erkennung von jedem Protein des Interesses14 ergänzt werden , 17 , 19.
Im Prinzip funktioniert iSCAT durch die Verstärkung des Proteins schwach gestreute Licht über interferometrischen mischen mit einer sekundären Referenz-Welle. Die ermittelte Intensität () in eine iSCAT Mikroskop wird beschrieben durch
wo ist die einfallende Intensität,
ist ein Koeffizient für den Beitrag der Referenz-Welle
steht für die Stärke der Streuung des Nano-Objekts unter Studie, und
ist die Phasenverschiebung zwischen den verstreuten und verweisen “Wellenlinien”14. Entweder die übertragenen oder Rückseite reflektiert einfallendes Licht dient in der Regel als Referenz Welle, wo in jedem Fall
entfallen die Transmissivität oder Reflektivität der Probenkammer, beziehungsweise. Der Begriff
ist proportional zu des Proteins Streuung Querschnitt und im Vergleich zu dem Kreuz Begriff vernachlässigt werden kann. Und setzt damit,
für komplette destruktive Interferenz der detektierten Lichts ergibt sich aus
wo
ist die Referenz-Intensität und
ist die Intensität der Störung.
iSCAT Mikroskopie bietet eine hervorragende Methode, um biologische Prozesse auf der Einzelmolekül-Ebene zu studieren. Als Beispiel, wir untersuchen Laz388 Zellen – eine Epstein – Barr-Virus (EBV) verwandelt sich B-Lymphozyten Zelle Zeile20,21 — wie sie Proteine wie IgG Antikörper16absondern. Aber die Methode ist allgemein und kann auf eine Vielzahl von anderen biologischen Systemen angewendet werden. iSCAT ist von Natur aus unspezifischen und erkennt kein Protein oder Nanopartikel oder es kann mit herkömmlichen Oberfläche Funktionalisierung Methoden für spezifische oder Multiplex-Erkennung erweitert werden. Seine Einfachheit und die Fähigkeit, mit anderen optischen Techniken, wie die Fluoreszenz-Mikroskopie, kombinierbar zu machen iSCAT ein wertvolles ergänzendes Instrument in der Zellbiologie.
Einer der wichtigsten Aspekte zur Gewinnung von Daten nützlich iSCAT ist die Fähigkeit, die richtige Fokuslage an der Oberfläche des Deckglases und darüber hinaus zu finden halten Sie diese Position für längere Zeit. Nichtbeachtung führt zu verbreiterte PSFs, schwache iSCAT Signale und Drift-assoziierten Artefakte im Dynamik-Analysen. Herausstellt, dass die Suche nach der Brennebene auf einem sauberen, blanken Deckgläschen Oberfläche nicht leichte Aufgabe ist da Oberflächen-Features nicht vor dem großen Referenz Strahl Hintergrund sichtbar sind (siehe Abbildung 4-d).
Rohe iSCAT Bilder sind oft verdeckt durch Hintergrund Signale, die von Wavefront Verunreinigungen in die Anregungsquelle entstehen, und kann behindern die Fähigkeit, die richtigen Abbildungsebene zu finden. Aktive Wavefront Subtraktion ist eine nützliche Methode, um dieses Problem zu umgehen und überwachen anschließend die iSCAT Fokus während einer Messung16. Eine Möglichkeit, dies zu erreichen ist durch räumliche Muster Modulation. In Kürze gilt ein Funktionsgenerator ein Rechtecksignal 50 Hz für externe Ansteuerung Hafen der Piezo-Bühne, wodurch eine räumliche Muster Modulation bei der angelegten Frequenz (290 nm Amplitude). Synchrone Kamera Akquisitionen werden aus der gleichen Quelle, und wenn durch Rastpositionen Grundsätze, Ergebnis in einem Wavefront kompensiert Bild14,16kombiniert ausgelöst. Das resultierende Bild zeigt in der Regel die Oberflächenrauigkeit des Deckglases (Abb. 4e). Kleine Features, die noch auf das Glas nach der Reinigung lässt sich das Mikroskop in den Mittelpunkt zu Rücken. Parameter für diesen aktiven Hintergrund Subtraktion Schritt können entsprechend der Bildrate, Belichtungszeit oder Hardware geändert werden.
Wie oben erwähnt, die einen qualitativ hochwertigen Strahlteiler im iSCAT Setup (Schritt 1.2.1.) wird empfohlen, als bildgebende Artefakte wie Ghosting oder Störungen aus dünnen planar Strahlteiler wird das Image beeinflussen und stören die Messung. Abbildung 7 zeigt einen Vergleich zwischen einer qualitativ hochwertigen und qualitativ minderwertige Strahlteiler. Beide roh iSCAT Bilder zeigen den gleichen Bereich auf das Deckglas, enthält einige Restpartikel. Das gleiche iSCAT-Setup wurde verwendet, um beide Bilder aufnehmen, nur der Strahlteiler wurde ausgetauscht. Abbildung 7a zeigt das Bild auf der Kamera durch Verwendung von dickeren (5 mm), gebildet AR-beschichtet und verkeilten Strahlteiler. Bauartbedingt eingekeilt der reflektierte Strahl von der Hinterfläche der Strahlteiler ist antiparallel zur Reflexion aus der vorderen Oberfläche und geht nicht ins Ziel. Keine Interferenzen Artefakte auftreten. Abbildung 7 zeigt die gleiche Sichtfeld auf die Probe, aber diesmal ein dünner (1 mm) planare Strahlteiler verwendet wurde. Die zwei Reflexionen von Vorder-und Rückseite der Strahlteiler sind parallel und werden auf die Kamera übertragen. Interferenz-Artefakte sind deutlich sichtbar.
Abbildung 7: Vergleich der iSCAT Bilder produziert mit hoher und niedriger Qualität Strahlteiler. (a) resultierende roh iSCAT Bild durch Verwendung einer 5 mm dicken, AR-beschichtet und verkeilten Strahlteiler. (b) resultierende roh iSCAT Bild des gleichen Gebietes durch Verwendung von einer 1 mm dicken planar Strahlteiler. Beide Strahlteiler haben das gleiche splitting-Verhältnis (50 % Reflexion, Transmission 50 %). Störungen Artefakte aus Fresnel Reflexionen sind eindeutig in das Bild mit dem 1 mm dicken planar Strahlteiler produziert beobachtet. Skalieren Sie Bars: 2 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
In diesem Protokoll beschreiben wir ein Weitfeld-Beleuchtung Schema für iSCAT, wie es ist schnell, einfach zu realisieren und ermöglicht die parallele Erfassung über eine große Fläche14. Eine andere Möglichkeit ist zu verwenden akusto-optischen Deflektoren (Bevollmächtigten) und Scannen Sie einen konfokalen Balken über der Probe12,17. Dieser Ansatz vermeidet die Notwendigkeit einer qualitativ hochwertigen Wellenfronten aber ist mehr experimentell Komplex als herkömmlicher Weitfeld-Bildgebung. Außerdem ist die Geschwindigkeit der konfokalen Beleuchtung von der Anweisungsbefugten beschränkt. Je nach der gewünschten Versuchsparameter können, entweder konfokale oder Weitfeld-Beleuchtung-Systeme im Prinzip genutzt werden, um einzelne Proteine, die aus lebenden Zellen abgesondert zu erkennen.
Wie im gesamten Protokoll erwähnt, ist es unerlässlich, seitliche mechanische Schwankungen in der Probe-Bühne des Mikroskops zu minimieren. Sogar Nanometer Abweichungen in der Position der Probe zu Variationen in aufeinander folgenden Kamera Rahmen führen und verursachen erhebliche äußere Rauschen im differenzierten Bild. Es empfiehlt sich daher, eine mechanisch stabile Mikroskoptisch und eine gedämpfte optischen Tisch (Schritt 1.1.1.) zu verwenden und das Setup mit optischen Vorhänge oder Paneele während eines Experiments (Schritt 3.5.) zu decken.
Eine aktive Fokus Stabilisierung Schema auch für Langzeitmessungen in Erwägung gezogen werden. Bei diesem Ansatz ist ein zweiter Laser integriert das Mikroskop in einer Totalreflexion (TIR) Anordnung und anschließend auf eine Photodiode Quadranten abgebildet. Änderungen in den Systemfokus übersetzen in seitlichen Verschiebungen des TIR Lasers vor Ort auf die Quadranten-Diode, die dann in ein aktives Feedback-Schleife verwendet werden kann, um die z-Achse der Piezo Stufe26zu steuern. Vertikale Drift Langzeitwirkungen sind somit ausgeschlossen.
Mehrere Änderungen und Erweiterungen können die vorgestellten Technik auf experimentelle Bedürfnisse Adresse zugewiesen werden. Zum Beispiel gibt es kommerzielle Mikroskop Bühne Inkubatoren, könnte leicht in iSCAT Mikroskop zur langfristigen Sicherung von Zellen aufgenommen werden. Andere Techniken können auch ergänzend iSCAT bildgebende Verfahren, wie z. B. umgesetzt werden konfokale oder TIR Fluoreszenz Microscopies17. Anpassung auf dem System unter Studie, iSCAT Sekretion, die Messungen in anderen Zelle Medien wie z. B. DMEM oder DPBS, durchgeführt werden können, sollte jedoch pH Indikator Phenol rot vermieden werden, da das Experiment durch Absorption des Laserlichts gestört werden kann. Darüber hinaus enthalten Ergänzungen wie fetalen Kälberserum (FCS) oder menschlichen Thrombozyten lysate (hPL) Proteine, die iSCAT Erkennung stören können. Abhängig von der gewünschten Empfindlichkeit des Experiments sollte diese Ergänzungen aus der Mikroskopie Medium ausgeschlossen werden.
iSCAT stützt sich auf ein Analyt Fähigkeit zu streuen Licht – eine Eigenschaft, die untrennbar mit allen Proteinen ist – und ist somit von Natur aus unspezifisch. Dennoch ist ein gewisses Maß an Spezifität als iSCAT Signale Skala linear mit Eiweiß Masse14,27,28möglich. Dies ermöglicht die Kalibrierung eines iSCAT Systems mit standard Proteinproben wie Rinderserumalbumin (BSA) und Fibrinogen14,27,28. In der Tat, vor kurzem junge Et al. 28 haben auf der Arbeit von Piliarik & Sandoghdar14 erweitert und haben gezeigt, dass iSCAT verwendet werden kann, um festzustellen, das Molekulargewicht der Proteine so klein wie Streptavidin (53 kDa) mit einer Massenauflösung 19 kDa und einer Genauigkeit von ca. 5 kDa. Mehrere konventionelle Ansätze können weitere iSCAT ergänzen, indem ein zusätzliches Maß an Spezifität. Als ein Beispiel, Enzym-linked Immunosorbentprobe Assays (ELISA) und/oder anderen Oberflächenmodifikationen Schränken Sie Protein Bindung Ereignisse so ein, dass nur das Zielprotein erkannten16ist.
In diesem Protokoll haben wir beschrieben, wie iSCAT Mikroskopie verwendet werden kann, zu untersuchen, zelluläre Sekrete auf einzelne Proteinebene mit Atemanhalten Zeitauflösung16. Die Technik ist allgemein und auf alle gewerblichen oder selbst gebaute Mikroskop umgesetzt werden kann. Im Gegensatz zu Einzelmolekül-Fluoreszenz die Methode leidet nicht Immunofluoreszenz oder Effekte, aber es blinkt immer noch Single-Protein Empfindlichkeit erreicht. Diese Eigenschaften machen iSCAT ein mächtiges Werkzeug im Bereich Biosensoren und Mikroskopie. Zukünftige Anwendungen konzentriert sich auf die Aufklärung von komplexen zellulärer Interaktionen z. B. immunologische Reaktion auf einen Stimulus oder zelluläre Kommunikation.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde von der Max-Planck-Gesellschaft, eine Alexander-von-Humboldt-Professur und der Deutschen Forschungsgemeinschaft (CRC 1181) unterstützt. Wir danken Stefanie Schaffer am Universitätsklinikum Erlangen, für die Laz388 Zellen und nützliche Diskussionen. Wir danken Simone Ihloff und Maksim Schwab bei MPL für den technischen Support.
Item/Device | |||
100x / 1.46 NA objective | Zeiss | 420792-9800-000 | alpha Plan Apochromat oil immersion |
20x / 0.4 NA objective | Leica | 566049 | N Plan |
Piezo Stage | PI | P-517k020 | 3-axis stage with 100x100x10µm range |
Diode laser (445 nm) | Lasertack | PD-01236 | |
Optics/Optomechanics | Thorlabs/Newport | – | lenses, mirrors, posts, mounts |
Pinhole | Thorlabs | P30H | |
LED light source | Thorlabs | MCWHL5 | |
Shortpass filter (580 nm) | Omega Optical | 580SP | to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation |
Longpass filter (500 nm) | Thorlabs | FEL0500 | to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation |
70R/30T beam splitter | Newport | 20Q20BS.1 | |
Economy beam splitter | Thorlabs | EBS1 | used for the comparison of fringe effects |
Wedged plate beam splitter | Thorlabs | BSW26 | used for the comparison of fringe effects |
Shortpass dichroic mirror (550 nm) | Edmund Optics | 66249 | |
8R/92T beam splitter | Thorlabs | BP108 | |
CMOS camera | Photonfocus | MV1-D1024E-160-CL | for iSCAT aquisition |
CMOS cameras | Mightex | SCE-B013-U | for bright field / fluorescence aquisition |
Longpass filter (600 nm) | Thorlabs | FELH0600 | |
Computer | Fujitsu Siemens | – | Core i7 Processor, 16 GB RAM, SSD |
Acquisition Software | LabVIEW | – | LabVIEW 2016 Suite |
Analysis Software | Matlab | – | Matlab 2014 Suite |
Plasma Cleaner | Diener | Diener pico | |
Incubator | Binder | Model CB | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Reagent/Material | |||
RPMI 1640 medium | Gibco | 11835063 | without phenol red |
HEPES Buffer Solution (1M) | Sigma Aldrich | 59205C | |
Cover slides | Marienfeld | 107052 | |
Glass bottom culture dishes | ibidi | 81158 | |
Fluorescent Microspheres | Invitrogen | F8821 | used for calibration |
Immersol immersion oil | Zeiss | 444960 | |
Propidium iodide stain | Invitrogen | R37108 | |
Small pipette tips | Eppendorf | 30075005 | |
Flexible pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
Ethanol, 99.8% | Fisher Scientific | E/0650DF/15 | |
Sodium hydroxide, pellets | Sigma Aldrich | 221465 | for preparing 0.2M NaOH solution |