Мы представляем протокол реального времени оптического обнаружения одного немеченого белков, как они сделаны секретным от живых клеток. Это основано на микроскопии интерферометрических рассеяния (iSCAT), который может быть применен к целый ряд различных биологических систем и конфигураций.
Мы демонстрируем микроскопии интерферометрических рассеяния (iSCAT), метод, способный обнаруживать одного немеченого белки, выделяется из отдельных живых клеток в режиме реального времени. В этом протоколе мы покрываем основные шаги для реализации iSCAT микроскопа и дополнить его с дополнительных изображений каналов для мониторинга жизнеспособность клеток под исследование. После этого мы используем метод для реального времени обнаружения одного белков, как они сделаны секретным от живой клетки, которые мы показываем увековечен линия B-клетки (Laz388). Обсуждаются необходимые шаги по подготовке микроскоп и образца, а также анализ записанных данных. Видео-протокол показывает микроскопии что iSCAT предлагает простой метод для изучения секрецию на уровне одной молекулы.
Секретируемые белки играют значительную роль в различных физиологических процессов1. Из-за этого они регулярно изучаются как коллективного ансамбль (протеомики) или как отдельные подразделения2,3. Протеомика традиционно исследует весь набор белков, присутствующих в конкретной системе биологических например, иммуноферментного анализа (ИФА), проточной цитометрии или масс-спектрометрии4,5, 6. Один белков, с другой стороны, обычно обнаруживаются с помощью различных методов, которые основаны на флуоресценции7,8, плазмоники9,10или криогенных электрона11 microscopies. Все эти методы используют сложные инструменты, маркировки или оба и часто не хватает динамики информацию, как только они доставить долгосрочные информацию о системе в рамках исследования.
Здесь мы используем iSCAT12,13 микроскопии смысл отдельных секреторной белки с секунды временное разрешение14. Важно отметить, что метод обнаруживает слабые рассеянного сигнала, присущих каждой белков12,14. Количество света, которое рассеивает небольшой bioparticle весы с его поляризуемость. Предполагая, что форма белка могут быть аппроксимированы эффективного рассеивания сфере14,,1516и что различные белки имеют очень похожие преломления, измеряемого сигнала может быть непосредственно подключен к молекулярной массой (МВт) белка. Эмпирические калибровки iSCAT контраст по сравнению с молекулярной массой измерениями ссылка позволяет отличить белков различных размеров. эксперименты iSCAT легко могут быть дополнены флуоресцентной микроскопии17,18, иммуносорбента реагентов, а также флуоресцентных или рассеивании этикетки для конкретного обнаружения любого белка интерес14 , 17 , 19.
В принципе iSCAT функции путем усиления белка слабый рассеянный свет через интерферометрических смешивания с волной Вторичный эталон. Обнаруженные интенсивность () в iSCAT описывается микроскопа
где -падающего света,
— коэффициент для вклада ссылка волны,
означает прочность рассеяния нано-объекта исследования, и
является сдвиг фазы между рассеянного и ссылки волны14. Либо переданы или обратно отражение падающего света обычно используется как ссылка волна, где в каждом случае
счета для пропускания или отражательной палаты образца, соответственно. Термин
пропорциональна белка рассеяния крест секции и можно пренебречь по сравнению с крест термин. Таким образом, установка
для полной разрушительного вмешательства, обнаруженных свет дается
где
ссылке интенсивность и
является интенсивность помех.
iSCAT микроскопии предлагает превосходный метод для изучения биологических процессов на уровне одной молекулы. В качестве примера, мы изучаем Laz388 клетки — превратил вирус Эпштейна по – Барр (EBV) лимфоцитов ячейки строки20,21 — как они выделяют белки, например IgG антитела16. Однако метод является общим и может применяться к целому ряду других биологических систем. iSCAT по сути неспецифических и может обнаружить любой белок или наночастиц, или он может быть продлен с общими методами Функционализация поверхности для обнаружения конкретных или мультиплексированных. Его простота и возможность быть объединены с другими оптическими методами, например микроскопии флуоресцирования, делают iSCAT ценный дополнительный инструмент в клеточной биологии.
Одним из наиболее важных аспектов для получения полезных iSCAT данных является возможность найти правильное положение фокуса на coverslip поверхности и, Кроме того, удерживайте эту позицию в течение длительных периодов времени. Неспособность сделать это приведет к расширенной PSFs, слабый iSCAT сигналов и дрейф связанных артефактов в анализе динамики. Оказывается, что нахождение фокальной плоскости на чистой, голые coverslip поверхность не является непростой задачей как особенности поверхности не видно на фоне пучка большой ссылки (см. Рисунок 4 d).
Сырые iSCAT изображения часто закрывались фон сигналы, которые возникают от волнового фронта примесей в источник возбуждения и может затруднить способность найти правильный изображений плоскости. Активные волновому вычитания является полезным способом обойти эту проблему и впоследствии контролировать iSCAT фокус во время измерения16. Один из способов добиться этого — через образца пространственной модуляции. Короче говоря функции генератора применяет 50 Гц квадратные волны к порту внешнего контроля пьезо стадии, что привело в образце spatial модуляции с прикладной частотой (амплитуда 290 Нм). Синхронные камеры приобретений инициируются из того же источника и, когда комбинированные через замок в принципы, результат в14,компенсацию волновому изображение16. Полученное изображение обычно показывает шероховатость поверхности coverslip (Рисунок 4e). Малые функции, оставаясь на стекле после очистки может использоваться для приведения микроскопом в фокус. Параметры, используемые для этого шага вычитание активных фона могут быть изменены согласно частота кадров, времени экспозиции или оборудования.
Как упоминалось выше, рекомендуется использовать высокое качество пучка сплиттер в iSCAT setup (шаг 1.2.1.), как изображений артефакты как ореолы или вмешательства, вытекающих из тонких плоских пучка сплиттер будут влиять на изображение и мешать измерения. Рисунок 7 показывает сравнение между высокого качества и низкого качества пучка сплиттер. Оба изображения raw iSCAT показывают того же района на coverslip, содержащая некоторые остаточных частиц. Те же установки iSCAT был использован для захвата изображений, обменялись только splitter луча. 7а Рисунок показывает изображение формируется на камеру с помощью толще (5 мм), AR-покрытием и клиновидные пучка сплиттер. Благодаря вклинивается дизайн отраженного луча от задней поверхности splitter луча анти параллельной к рефлексии, вытекающих из передней поверхности и не вступает в цель. Происходят без вмешательства артефактов. Рисунок 7b показывает же поле зрения на образце, но на этот раз тоньше splitter Вселенский луча (1 мм) был использован. Два отражения от передней и задней поверхностей splitter луча параллельны и распространять на камеру. Хорошо видны артефакты вмешательства.
Рисунок 7: сравнение iSCAT изображений производится с высокого и низкого качества пучка сплиттер. () результирующий сырье iSCAT образ с использованием 5 мм толщиной, AR-покрытием и клиновидные пучка сплиттер. (b) результирующий образ сырье iSCAT той же площади с использованием 1 мм толщиной Вселенский пучка сплиттер. Оба пучка сплиттер имеют же коэффициент разделения (50% отражения, передача 50%). Вмешательство артефакты, возникающие от отражения Френеля четко прослеживается в создаваемые с 1 мм толщиной Вселенский пучка сплиттер изображения. Масштаб бары: 2 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
В этом протоколе мы описываем схему освещения поля для iSCAT, как это быстро, легко понять и позволяет для параллельных зондирования над большой площади14. Другой распространенный подход — использовать акустооптические дефлекторы (крыльчатках) и сканирование конфокальный пучка через образец12,17. Этот подход позволяет избежать необходимости для wavefronts высокого качества но экспериментально более сложным, чем обычные-поля изображений. Кроме того, что крыльчатках ограничивается скорость конфокальный освещения. В зависимости от желаемого экспериментальные параметры либо конфокальный или поля освещение схемы можно в принципе, использовать для определения единого белков, выделяется из живых клеток.
Как обсуждалось на протяжении протокол, важно свести к минимуму боковое механические колебания в стадии образца микроскопа. Даже нанометра отклонения в положении образца может привести к вариации в рамках последовательных камеры и вызвать значительные посторонний шум в изображении дифференциальной. Поэтому рекомендуется использовать механически стабильной микроскопа и затуханием таблицы оптики (шаг 1.1.1.) и для покрытия установки с оптическим шторы или панелей во время эксперимента (шаг 3.5.).
Схемы стабилизации активный фокус может также рассматриваться для долгосрочных измерений. В этом подходе второй лазер включены в Микроскоп в механизме полного внутреннего отражения (МДП) и впоследствии образы на фотодиод квадранта. Изменения в системе в фокусе перевести на боковые смещения МДП лазерного пятна на квадранте диод, который затем может использоваться в цикле активной обратной связи для управления z-axis пьезо этап26. Таким образом устраняются долгосрочные эффекты вертикальное смещение.
В представленных технику для удовлетворения конкретных потребностей экспериментальный может применяться несколько модификаций и расширений. Например, доступны коммерческие микроскоп этапа инкубаторы, легко могут быть включены в iSCAT микроскоп для долгосрочное изображений клеток. Другие методы также могут осуществляться в дополнение к iSCAT визуализации, такие как конфокальный или МДП флуоресценции microscopies17. Для адаптации системы под исследование, iSCAT секреции, что измерения может осуществляться в других средствах массовой информации клетки например DMEM или DPBS, однако, фенола красный индикатор рН следует избегать как это может нарушить эксперимент вследствие поглощения лазерного света. Кроме того добавки, как плода телячьей сыворотки (FCS) или человека тромбоцитов lysate (hPL) содержат белки, которые могут помешать iSCAT обнаружения. В зависимости от желаемого чувствительность эксперимента эти добавки должны быть исключены из среднего микроскопии.
iSCAT опирается на способность аналита рассеивают свет — свойство, которое является неотъемлемым элементом всех белков — и таким образом по сути неспецифические. Тем не менее некоторые степень конкретности возможен как шкала сигналов iSCAT линейно с белком массового14,27,28. Это позволяет для калибровки iSCAT системы, используя образцы стандартных протеина, например бычьим сывороточным альбумином (БСА) и фибриногена14,27,28. В самом деле, совсем недавно, молодых и др. 28 распространились по работе Piliarik и Sandoghdar14 и показали, что iSCAT может использоваться для определения низкомолекулярных белков, как малые, как стрептавидина (53 кДа) с разрешением массового 19 кДа и с точностью около 5 кДа. Далее несколько обычных подходов может дополнять iSCAT, обеспечивая дополнительный уровень конкретности. Как пример, энзим соединенный иммуноферментного анализа (ИФА), и/или других поверхностных модификаций, ограничить события привязки, так что только целевой белок является белок обнаружен16.
В этом протоколе мы описали, как iSCAT микроскопии могут быть использованы расследовать сотовой выделениями на уровне одного белка с обеспечивается временное разрешение16. Техника является общим и могут быть реализованы для любой коммерческой или построил дом микроскопа. В отличие от одной молекулы флуоресценции подходы метод не страдают от Фотообесцвечивание или мигает эффекты, но она по-прежнему достигает одного белка чувствительность. Эти особенности делают iSCAT мощный инструмент в области biosensing и микроскопии. Будущих приложений будет сосредоточена на разъяснение сложных сотовой взаимодействиями, такими как иммунологический ответ на раздражитель или сотовой связи.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Общество Макса Планка, профессора Александра фон Гумбольдта и Deutsche Forschungsgemeinschaft (CRC 1181). Мы благодарим Stefanie Schaffer Universitätsklinikum Erlangen для обеспечения Laz388 клеток и полезные обсуждения. Мы благодарим Симона Ihloff и Максим Schwab MPL для технической поддержки.
Item/Device | |||
100x / 1.46 NA objective | Zeiss | 420792-9800-000 | alpha Plan Apochromat oil immersion |
20x / 0.4 NA objective | Leica | 566049 | N Plan |
Piezo Stage | PI | P-517k020 | 3-axis stage with 100x100x10µm range |
Diode laser (445 nm) | Lasertack | PD-01236 | |
Optics/Optomechanics | Thorlabs/Newport | – | lenses, mirrors, posts, mounts |
Pinhole | Thorlabs | P30H | |
LED light source | Thorlabs | MCWHL5 | |
Shortpass filter (580 nm) | Omega Optical | 580SP | to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation |
Longpass filter (500 nm) | Thorlabs | FEL0500 | to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation |
70R/30T beam splitter | Newport | 20Q20BS.1 | |
Economy beam splitter | Thorlabs | EBS1 | used for the comparison of fringe effects |
Wedged plate beam splitter | Thorlabs | BSW26 | used for the comparison of fringe effects |
Shortpass dichroic mirror (550 nm) | Edmund Optics | 66249 | |
8R/92T beam splitter | Thorlabs | BP108 | |
CMOS camera | Photonfocus | MV1-D1024E-160-CL | for iSCAT aquisition |
CMOS cameras | Mightex | SCE-B013-U | for bright field / fluorescence aquisition |
Longpass filter (600 nm) | Thorlabs | FELH0600 | |
Computer | Fujitsu Siemens | – | Core i7 Processor, 16 GB RAM, SSD |
Acquisition Software | LabVIEW | – | LabVIEW 2016 Suite |
Analysis Software | Matlab | – | Matlab 2014 Suite |
Plasma Cleaner | Diener | Diener pico | |
Incubator | Binder | Model CB | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Reagent/Material | |||
RPMI 1640 medium | Gibco | 11835063 | without phenol red |
HEPES Buffer Solution (1M) | Sigma Aldrich | 59205C | |
Cover slides | Marienfeld | 107052 | |
Glass bottom culture dishes | ibidi | 81158 | |
Fluorescent Microspheres | Invitrogen | F8821 | used for calibration |
Immersol immersion oil | Zeiss | 444960 | |
Propidium iodide stain | Invitrogen | R37108 | |
Small pipette tips | Eppendorf | 30075005 | |
Flexible pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
Ethanol, 99.8% | Fisher Scientific | E/0650DF/15 | |
Sodium hydroxide, pellets | Sigma Aldrich | 221465 | for preparing 0.2M NaOH solution |