우리는 응용 프로그램 제어 기계 부하 또는 영향의 후 그대로 murine 관절의 관절 표면에 세포 상해/죽음의 공간 범위를 평가 하는 방법을 제시. 관절염, 유전 요인 및 다른 로드 regimens 영향 chondrocytes 제자리에서 의 취약점을 조사 하기 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다.
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방법 논문
실시간 시각화 및 Chondrocyte 부상 때문에 완전히 그대로 Murine 연골 Explants 기계적 부하의 분석
이 논문에서
요약
초록
관절 연골의 항상성 주민 세포 (chondrocytes)의 생존 능력에 따라 달라 집니다. 불행 하 게도, 기계적 외상은 잠재적으로 공동의 돌이킬 수 없는 고장 및 관절염의 발병에 이르는 광범위 한 chondrocyte 죽음을 유도할 수 있다. 또한, chondrocyte 생존 능력의 유지 관리는 최적의 수술 결과 대 한 osteochondral 이식 절차에서 중요 하다. 우리는 응용 프로그램 제어 기계 부하 또는 영향의 후 그대로 murine 활 액 관절의 관절 표면에 세포 상해/죽음의 공간 범위를 평가 하는 방법을 제시. 이 메서드는 다른 기계적 부하 regimens, 다른 환경 조건이 나 유전자 조작의 효과 뿐만 아니라 다른 단계에 짧은-장기 연골 변성의 조사 비교 연구에 사용할 수 있습니다. 원래의 관절 chondrocytes의 취약점입니다. 원고에 소개 하는 프로토콜의 목표 murine 활 액 관절의 관절 표면에 세포 상해/죽음의 공간 범위를 평가입니다. 중요 한 것은,이 메서드는 네이티브 경계 조건 없이 완전히 그대로 연골에 테스트 수 있습니다. 또한, 그것은 vitally 스테인드 관절 chondrocytes의 실시간 시각화 및 제어 정적 및 영향 regimens 로드의 응용 프로그램에 의해 유도 된 세포 상해의 단일 이미지 기반 분석에 대 한 수 있습니다. 우리의 대표적인 결과 건강 한 연골 explants 세포 상해의 공간적 범위에 따라 달라 집니다 민감하게 부하 강도 및 충격 강도 보여줍니다. 우리의 방법은 쉽게 다른 기계적 부하 regimens, 다른 환경 조건이 나 관절 chondrocytes 제자리에 의 기계적인 취약점에 다른 유전자 조작의 효과 조사 하기 위해 적용할 수 있습니다.
서론
관절 연골 (AC)는 베어링 커버와 부드러운 공동 조음을 제공 하는 활 액 관절에서 뼈를 보호 하는 조직 로드. 조직의 항상성 chondrocytes, AC에 있는 유일한 셀 타입의 생존 능력에 따라 달라 집니다. 그러나, 극단적인 세력 (예를 들어, 폭포, 차량 사고 또는 스포츠 부상) 외상 또는 외상 후 관절 불안정성 때문에 연골의 노출 chondrocyte 죽음, 관절 (관절염)의 돌이킬 수 없는 고장에 지도 일으킬 수 있다 1. 또한, osteochondral 손상 된 연골에 로컬 결함을 복구 하는 것을 목표로 하는 절차를 접목, 이식 삽입 관련 된 기계적 외상 chondrocyte 생존 능력을 감소에 수술 결과2에 해로운 효과가 있다.
연골 explant 모델 일반적으로 기계적으로 유도 된 세포 죽음을 관절 chondrocytes의 민감성을 공부 하는 데 사용 됩니다. 이러한 모델 일반적으로를 사용 하 여 큰 동물에서 explants 로드 조건, 환경 조건 및 셀 취약점3,,45....
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프로토콜
모든 동물 작업 동물 자원에 로체스터의 대학 위원회에 의해 승인 되었다.
1입니다. 솔루션
- 행 크의 균형 소금 솔루션 준비 (1 X HBSS) 포함 하는 칼슘, 마그네슘, 아무 페 놀 레드. HCl 이나 NaOH의 소량을 추가 하 여 pH 7.4에 조정 합니다.
- NaCl 또는 이온된 수를 추가 하 여 303 mOsm osmolarity를 조정 합니다. 버퍼를 사용 하 여 해, 견본 준비 및 기계적 테스트 중.
2. 원심 대 퇴 골과 완벽 하 게 그대로 관절 연골과 근 위 상 완 골의 해
- 뒤에 자 궁 경부 전위 공동2 흡입 챔버를 사용 하 여 기관의 지침에 따라 마우스를 안락사 무 균 기술을 통해 따릅니다.
참고: 8 및 81 주 어떤 긴장의 오래 된과 섹스 사이의 마우스 사용할 수 있습니다. - 해에 대 한 다음과 같은 수술 도구를 사용 하 여: 마이크로-가 위 (절 개를 만들기 위해 사용), 표준 해가 위 (뼈를 절단 사용), # 11와 메스 메스 블레이드 (절단 부드러운 조직에 사용), 보석의 집게 (소프트의 제거에 사용 조직) 및 표준 집게 (부드러운 조직과 피부 필 링에 사용).
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결과
6 다른 로드 프로토콜 적용 (정적 로드: 0.1 N, 0.5 N과 N 5 분; 및 충격 부하에 대 한 1: 1 엠 제이, 2 엠 4 엠 제이) reproducibly 8 10 주 오래 BALB/c 마우스 (에서 가져온 하는 대 퇴와 상 박 골의 연골에 세포 상해의 정량 지역화 된 영역을 유도 그림 2)입니다. 중요 한 것은, 관절 표면에 chondrocyte 상해의 공간 정도 ImageJ에 신속 하 고 쉽게 측정 했다. 대표 결과 관절 chondrocytes의 기계적인 취약점은 부하 강도 및 충격 강도 의해 영향을 보여줍니다. 특히, 높은 부하 크기 및 높은 충격 강도 크게 화관에 humeri (그림 3) 세포 상해의 공간 정도 악화.
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토론
위에서 설명한 방법 기계적 부하 또는 충격 처방 후 마우스 관절에서 관절 chondrocytes 실용적이 고 부상/죽은 현장에서 시각화를 성공적으로 채택 되었다. 특히, 우리는 두 개의 서로 다른 활 액 관절에서 완전히 그대로 관절 연골 내 chondrocytes의 기계적인 취약점 분석 수 있었다: 무릎 관절 (원심 화관)와 어깨 (humeri). 우리의 대표적인 결과 관절 표면에 세포 상해의 공간 정도 부하 크기와 충격 강도 (그림 3)에 민감하게 의존을 보여준다. 중요 한 것은,이 메서드를 사용 하 여 순수 관련 조건 기계적 부하에 세포질 응답의 조사를 지원합니다. 즉,는 그대로 생리 아래 관절에 관절 연골의 테스트 가능 하 고 supraphysiological 로드 ( 보충 파일 1참조: 2 절).
기준선, 일부 프로토콜 수정에 chondrocy.......
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
저자는 그들의 pH 미터 및 osmometer의 관대 한 사용에 대 한 박사 리처드 Waugh와 루이스 Delgadillo을 감사 하 고 싶습니다. 또한, 저자 안드레아 리 기계 테스트 시스템의 초기 발전에 기여 하는 것을 감사 하 고 싶습니다. 이 연구는 NIH P30 AR069655에 의해 투자 되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 칼세인, 오전 | Thermo Fisher Scientific C3100MP의 Invitrogen | 20x50mg , Eugene, OR, USA | |
| Thermo Fisher Scientific | P3566 | mg/mL 용액 in water, 10mL, Eugene, OR, USA | |
| 디메틸 설폭사이드(DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | 1L DMSO, 무수; 99.9%, 세인트루이스, 미주리, 미국 |
| HBSS (칼슘, 마그네슘, 페놀 레드 없음) | Gibco by Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | 1X, 500mL, Grand Island, NY, USA |
| 깃털 수술용 칼날 (#11) | VWR | 102097-822 | Hatfield, PA, USA |
| 증기압 오스모미터, VAPRO | ELITechGroup | 모델 5520 | Puteaux, France |
| pH meter | Beckman | 모델 Phi 32 | 브레아, 캘리포니아, 미국 |
| Eppendorf 써모믹서 | 에펜도르프 AG | 모델 5350 | 독일 함부르크 |
| 도립 연구 현미경 | 올림무스 | 모델 IX-81 | Center Valley, PA, USA |
| 목재 어플리케이터 | Puritan Medical Products Company, LLC | 807 | 6"x100, Guilford, ME, USA |
| 1.5 유리 커버슬립 | Warner Instruments, LLC | 64-1696 | #1.5, 0.17mm 두께, 40mm 직경, Hamden, CT, USA |
참고문헌
- Lotz, M. K., Kraus, V. B. New developments in osteoarthritis. Posttraumatic osteoarthritis: pathogenesis and pharmacological treatment options. Arthritis Research & Therapy. 12 (3), 211(2010).
- Pallante, A. L., et al.
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재인쇄 및 허가
