Visualisatie in real time en analyse van chondrocyten letsel als gevolg van mechanische belasting in volledig Intact lymfkliertest kraakbeen explantaten
Summary
Presenteren we een methode voor de beoordeling van de ruimtelijke omvang van verwonding/dood van de cel op het gewrichtsoppervlak van intact lymfkliertest gewrichten na toepassing van gecontroleerde mechanische belastingen of effecten. Deze methode kunt u nagaan hoe artrose, genetische factoren en/of verschillende laden regimes van invloed zijn op de kwetsbaarheid van in situ chondrocyten worden gebruikt.
Abstract
Homeostase van articulair kraakbeen, is afhankelijk van de levensvatbaarheid van resident cellen (chondrocyten). Helaas, mechanische trauma kan veroorzaken wijdverspreide chondrocyten dood, mogelijk leiden tot onomkeerbare uitsplitsing van het gewricht en het begin van artrose. Onderhoud van chondrocyten levensvatbaarheid is bovendien belangrijk in osteochondrale graft procedures voor optimale chirurgische resultaten. Presenteren we een methode voor de beoordeling van de ruimtelijke omvang van verwonding/dood van de cel op het gewrichtsoppervlak van intact lymfkliertest synoviale gewrichten na toepassing van gecontroleerde mechanische belastingen of effecten. Deze methode kan worden gebruikt in vergelijkende studies te onderzoeken van de effecten van verschillende mechanische belasting regimes, verschillende milieuomstandigheden of genetische manipulaties, evenals verschillende stadia van degeneratie van het kraakbeen op korte – en/of op lange termijn kwetsbaarheid van in situ articulaire chondrocyten. Het doel van het protocol geïntroduceerd in het manuscript is te beoordelen van de ruimtelijke omvang van verwonding/dood van de cel op het gewrichtsoppervlak van lymfkliertest synoviale gewrichten. Nog belangrijker is, is deze methode kan testen op volledig intact kraakbeen zonder afbreuk te doen aan de inheemse randvoorwaarden. Bovendien zorgt het voor visualisatie in real time van vitaal gebeitst articulaire chondrocyten en één beeld-gebaseerde analyse van cel letsel veroorzaakt door toepassing van gecontroleerde statische en effect laden regimes. Onze representatieve resultaten tonen aan dat in gezond kraakbeen explantaten, de ruimtelijke omvang van cel schade gevoelig belasting omvang en het effect intensiteit hangt. Onze methode kan gemakkelijk aangepast worden aan onderzoeken van de effecten van verschillende mechanische belasting regimes, verschillende milieuomstandigheden of verschillende genetische manipulaties op de mechanische kwetsbaarheid van in situ articulaire chondrocyten.
Introduction
Articulair kraakbeen (AC) is een dragende weefsel dat behandelt en beschermt botten in synoviale gewrichten, verstrekken van vlotte gezamenlijke articulatie. Weefsel homeostase is afhankelijk van de levensvatbaarheid van de chondrocyten, de enige celtype die woonachtig zijn in AC. Echter kan Gasbedwelming met behulp van kraakbeen extreme krachten als gevolg van trauma (bijv, falls, voertuig ongeval of sport letsel) of als gevolg van post-traumatische gezamenlijke instabiliteit veroorzaken chondrocyten dood, wat leidt tot onomkeerbare uitsplitsing van het gewricht (artrose) 1. bovendien in osteochondrale enten procedures die gericht zijn op plaatselijke gebreken in beschadigd kraakbeen, graft invoeging-geassocieerde mechanische trauma vermindert chondrocyten levensvatbaarheid en heeft nadelige gevolgen voor chirurgische resultaten2.
Kraakbeen explant modellen worden gebruikt bij het bestuderen van de gevoeligheid van de articulaire chondrocyten voor mechanisch-veroorzaakte celdood. Deze modellen gebruiken meestal explantaten van grote dieren te bestuderen van de gevolgen van het laden van de voorwaarden, de omgevingsomstandigheden en andere factoren op cel beveiligingslek3,4,5,6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15. Echter, als gevolg van de grote omvang van de inheemse gewrichten, deze modellen in het algemeen vereisen verwijdering van een stekker uit het gewrichtsoppervlak van een intact gewricht, waardoor afbreuk te doen aan inheemse randvoorwaarden. Bovendien, ze over het algemeen vergt toepassing van grote mechanische belastingen voor het opwekken van cel letsel. U kunt ook bieden lymfkliertest kraakbeen explant modellen verschillende voordelen ten opzichte van grotere dierlijke modellen bij het bestuderen van de mechanische kwetsbaarheid van in situ chondrocyten. Met name als gevolg van hun kleinere afmetingen vergemakkelijken deze modellen testen van volledig intact articulair kraakbeen zonder te veranderen van inheemse weefsel integriteit. Bovendien, laden van lymfkliertest kraakbeen vindt plaats via kleine contact gebieden zodanig dat chondrocyten dood/letsel kan worden opgewekt met kleine lastdragers (< 1 N). Tot slot, het genoom van de muis wordt gemakkelijk gemanipuleerd, waardoor testen van hoe specifieke genen invloed op de gevoeligheid van in situ chondrocyten voor mechanische schade.
Het algemene doel van de methode geïntroduceerd in dit manuscript is te kwantificeren en visualiseren-in real-tijd-de ruimtelijke omvang van in situ cel dood/letsel als gevolg van de toegepaste mechanische belastingen op volledig intact muis kraakbeen-op beendermeel explants in vitro. Deze methode vereist zorgvuldige dissectie van muis synoviale gewrichten zonder afbreuk te doen aan de levensvatbaarheid van de chondrocyten, gevolgd door mechanische beproeving van vitaal gebeitst explantaten met behulp van een Microscoop gemonteerde apparaat vergelijkbaar met een test platform dat we onlangs ontwikkeld te kwantificeren lymfkliertest kraakbeen mechanische eigenschappen16. Tijdens het testen van de mechanische, is een groot deel van de (intacte) gewrichtsoppervlak van het bot ontleed zichtbaar op een opname van één fluorescentie, waardoor snelle analyse van de levensvatbaarheid van de cellen, nadat een belasting is toegepast. Een soortgelijke analyse van de levensvatbaarheid van de cellen van de oppervlakte in lymfkliertest kraakbeen explantaten is uitgevoerd eerder, maar zonder gelijktijdige toepassing van belasting17. Potentiële toepassingen van onze methode omvatten vergelijkende studies om te onderzoeken van de kwetsbaarheid van de articulaire chondrocyten aan verschillende gecontroleerde milieu- en mechanische omstandigheden, alsmede screening van behandelingen gericht op het verminderen van de gevoeligheid van chondrocyten aan mechanische belasting.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hierboven beschreven methoden werden met succes ingezet om te visualiseren van levensvatbare en gewond/dode in situ articulaire chondrocyten van muis gewrichten nadat voorgeschreven mechanische belastingen of effecten. In het bijzonder, konden we voor het analyseren van de mechanische kwetsbaarheid van chondrocyten binnen volledig intact articulair kraakbeen uit twee verschillende synoviale gewrichten: het kniegewricht (distale dijbeen) en schouder (humeri). Onze representatieve resultaten tonen aan dat de ru…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedank Dr. Richard Waugh en Luis Delgadillo voor het royale gebruik van hun pH-meter en osmometer. Bovendien, bedank de auteurs Andrea Lee bij te dragen tot de initiële ontwikkeling van de mechanische testsysteem. Deze studie werd gefinancierd door de NIH P30 AR069655.
Materials
| Calcein, AM | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | C3100MP | 20x50mg , Eugene, OR, USA |
| Propidium Iodide | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | P3566 | 1 mg/mL solution in water, 10mL, Eugene, OR, USA |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | 1L DMSO, anhydrous, ≥99.9%, St. Louis, MO, USA |
| HBSS (calcium, magnesium, no phenol red) | Gibco by Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | 1X, 500mL, Grand Island, NY, USA |
| Feather surgical blade (#11) | VWR | 102097-822 | Hatfield, PA, USA |
| Vapor pressure osmometer, VAPRO | ELITechGroup | Model 5520 | Puteaux, France |
| pH meter | Beckman | Model Phi 32 | Brea, CA, USA |
| Eppendorf thermomixer | Eppendorf AG | Model 5350 | Hamburg, Germany |
| Motorized inverted research microscope | Olypmus | Model IX-81 | Center Valley, PA, USA |
| Wooden applicator | Puritan Medical Products Company, LLC | 807 | 6"x100, Guilford, ME, USA |
| 1.5 Glass coverslips | Warner Instruments, LLC | 64-1696 | #1.5, 0.17mm thick, 40mm diameter, Hamden, CT, USA |
References
- Lotz, M. K., Kraus, V. B. New developments in osteoarthritis. Posttraumatic osteoarthritis: pathogenesis and pharmacological treatment options. Arthritis Research & Therapy. 12 (3), 211 (2010).
- Pallante, A. L., et al. The in vivo performance of osteochondral allografts in the goat is diminished with extended storage and decreased cartilage cellularity. American Journal of Sports Medicine. 40 (8), 1814-1823 (2012).
- Delco, M. L., Bonnevie, E. D., Bonassar, L. J., Fortier, L. A. Mitochondrial dysfunction is an acute response of articular chondrocytes to mechanical injury. Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 739-750 (2018).
- Ewers, B. J., Dvoracek-Driksna, D., Orth, M. W., Haut, R. C. The extent of matrix damage and chondrocyte death in mechanically traumatized articular cartilage explants depends on rate of loading. Journal of Orthopaedic Research. 19 (5), 779-784 (2001).
- Goodwin, W., et al. Rotenone prevents impact-induced chondrocyte death. Journal of Orthopaedic Research. 28 (8), 1057-1063 (2010).
- Issa, R., Boeving, M., Kinter, M., Griffin, T. M. Effect of biomechanical stress on endogenous antioxidant networks in bovine articular cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 760-769 (2018).
- Bartell, L. R., Fortier, L. A., Bonassar, L. J., Cohen, I. Measuring microscale strain fields in articular cartilage during rapid impact reveals thresholds for chondrocyte death and a protective role for the superficial layer. Journal of Biomechanics. 48 (12), 3440-3446 (2015).
- Levin, A. S., Chen, C. T., Torzilli, P. A. Effect of tissue maturity on cell viability in load-injured articular cartilage explants. Osteoarthritis and Cartilage. 13 (6), 488-496 (2005).
- Lee, W., et al. Synergy between Piezo1 and Piezo2 channels confers high-strain mechanosensitivity to articular cartilage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (47), E5114-E5122 (2014).
- Jeffrey, J. E., Gregory, D. W., Aspden, R. M. Matrix damage and chondrocyte viability following a single impact load on articular cartilage. Archives of Biochemistry and Biophysics. 322 (1), 87-96 (1995).
- Chen, C. T., Bhargava, M., Lin, P. M., Torzilli, P. A. Time, stress, and location dependent chondrocyte death and collagen damage in cyclically loaded articular cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 21 (5), 888-898 (2003).
- Morel, V., Mercay, A., Quinn, T. M. Prestrain decreases cartilage susceptibility to injury by ramp compression in vitro. Osteoarthritis and Cartilage. 13 (11), 964-970 (2005).
- Sauter, E., Buckwalter, J. A., McKinley, T. O., Martin, J. A. Cytoskeletal dissolution blocks oxidant release and cell death in injured cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 30 (4), 593-598 (2012).
- Martin, J. A., Buckwalter, J. A. Post-traumatic osteoarthritis: the role of stress induced chondrocyte damage. Biorheology. 43 (3,4), 517-521 (2006).
- Martin, J. A., Brown, T., Heiner, A., Buckwalter, J. A. Post-traumatic osteoarthritis: the role of accelerated chondrocyte senescence. Biorheology. 41 (3-4), 479-491 (2004).
- Kotelsky, A., Woo, C. W., Delgadillo, L. F., Richards, M. S., Buckley, M. R. An Alternative Method to Characterize the Quasi-Static, Nonlinear Material Properties of Murine Articular Cartilage. Journal of Biomechanical Engineering. 140 (1), (2018).
- Zhang, M., et al. Induced superficial chondrocyte death reduces catabolic cartilage damage in murine posttraumatic osteoarthritis. Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 2893-2902 (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Habouri, L., et al. Deletion of 12/15-lipoxygenase accelerates the development of aging-associated and instability-induced osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (10), 1719-1728 (2017).
- Higuchi, Y., et al. Conditional knockdown of hyaluronidase 2 in articular cartilage stimulates osteoarthritic progression in a mice model. Scientific Reports. 7 (1), 7028 (2017).
- Zhu, M., et al. Activation of beta-catenin signaling in articular chondrocytes leads to osteoarthritis-like phenotype in adult beta-catenin conditional activation mice. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (1), 12-21 (2009).
- Hu, K., et al. Pathogenesis of osteoarthritis-like changes in the joints of mice deficient in type IX collagen. Arthritis & Rheumatology. 54 (9), 2891-2900 (2006).
- Mooney, R. A., Sampson, E. R., Lerea, J., Rosier, R. N., Zuscik, M. J. High-fat diet accelerates progression of osteoarthritis after meniscal/Ligamentous injury. Arthritis Research & Therapy. 13 (6), R198 (2011).
- Griffin, T. M., Huebner, J. L., Kraus, V. B., Yan, Z., Guilak, F. Induction of osteoarthritis and metabolic inflammation by a very high-fat diet in mice: effects of short-term exercise. Arthritis & Rheumatology. 64 (2), 443-453 (2012).
- Kamekura, S., et al. Osteoarthritis development in novel experimental mouse models induced by knee joint instability. Osteoarthritis and Cartilage. 13 (7), 632-641 (2005).
- Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
- Huang, H., Skelly, J. D., Ayers, D. C., Song, J. Age-dependent Changes in the Articular Cartilage and Subchondral Bone of C57BL/6 Mice after Surgical Destabilization of Medial Meniscus. Scientific Reports. 7, 42294 (2017).
- Hamada, D., Sampson, E. R., Maynard, R. D., Zuscik, M. J. Surgical induction of posttraumatic osteoarthritis in the mouse. Methods in Molecular Biology. 1130, 61-72 (2014).
- Wilhelmi, G., Faust, R. Suitability of the C57 black mouse as an experimental animal for the study of skeletal changes due to ageing, with special reference to osteo-arthrosis and its response to tribenoside. Pharmacology. 14 (4), 289-296 (1976).
- Stoop, R., et al. Type II collagen degradation in spontaneous osteoarthritis in C57Bl/6 and BALB/c mice. Arthritis & Rheumatism. 42 (11), 2381-2389 (1999).
- McNeil, P. L., Kirchhausen, T. An emergency response team for membrane repair. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (6), 499-505 (2005).
- Adebayo, O. O., et al. Kinematics of meniscal- and ACL-transected mouse knees during controlled tibial compressive loading captured using roentgen stereophotogrammetry. Journal of Orthopaedic Research. 35 (2), 353-360 (2017).
- Vahedipour, A., et al. Uncovering the structure of the mouse gait controller: Mice respond to substrate perturbations with adaptations in gait on a continuum between trot and bound. Journal of Biomechanics. , (2018).
