تنقية و في المختبر نشاط الإنزيم (ع) بجب سينثاتيز من المطثيّة العسيرة
Summary
هنا، يمكننا وصف طريقة لتنقية الإنزيمات معلم الحامض الأميني بيروفوسفوكيناسي واستخدام طبقة رقيقة اللوني من ركائز راديولابيليد ومنتجات الاعتداء للنشاط الأنزيمي في المختبر. مقايسة نشاط إنزيم قابل للتطبيق على نطاق واسع لأي كيناز، cyclase النوكليوتيدات، أو رد فعل الفوسفور ونقل إليه الذي يتضمن التحلل ثلاثي الفوسفات النوكليوتيدات.
Abstract
إنزيمات كيناز وبيروفوسفوكيناسي نقل الفوسفات غاما أو مجموعة بيروفوسفات بيتا-غاما من السلائف ثلاثي الفوسفات النوكليوتيدات إلى ركائز لخلق منتجات فوسفوريلاتيد. الاستخدام γ-32-ف المسمى السلائف NTP يسمح الرصد المتزامن الركازة الانتفاع والمنتج تكوين بالأشعة. طبقة رقيقة اللوني (TLC) على لوحات السيلولوز يسمح الفصل السريع والكمي الحساسة للركيزة والمنتج. نحن نقدم طريقة لاستخدام كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة الاعتداء نشاط بيروفوسفوكيناسي سينثاتيز بجب (ف) المنقي. هذا الأسلوب قد استخدمت سابقا لوصف نشاط دوري سينثيتاسيس النوكليوتيدات ودينوكليوتيدي، وهو مناسبة على نطاق واسع لوصف نشاط أي إنزيم هيدروليزيس ثلاثي الفوسفات النوكليوتيدات سندات أو نقل محطة طرفية الفوسفات من مانح فوسفات إلى جزيء آخر.
Introduction
إنزيمات كيناز وبيروفوسفوكيناسي (أو ديفوسفو-كيناز) نقل الفوسفات من النوكليوتيدات ثلاثي الفوسفات (NTP) السلائف إلى جزيئات الركازة. يمكن أن تتضمن ركائز أخرى النيوكليوتيدات والأحماض الأمينية أو البروتينات والكربوهيدرات والدهون1. في بعض الأحيان يمكن التنبؤ بها تحليلات Bioinformatic الركازة المشابهة لأنزيم أو ركائز استناداً إلى التشابه للإنزيمات تتميز، ولكن لا يزال من الضروري التحقق التجريبي. وبالمثل، تقارب إنزيم substrate(s)، ومعدل أنه يحفز رد الفعل الفوسفور والنقل، وآثار العوامل المشتركة، ومثبطات، أو المستجيبة الإنزيم يجب أن يتحدد تجريبيا. تجنب استنزاف السلائف ATP بسائر الإنزيمات ATP المستهلكة الموجودة في السيتوبلازم البكتيري، تتطلب فحوصات النشاط كمية البروتين المنقي.
تنقية البروتين اللوني تقارب معدنية قطعت تماما في الأدب2،3. تسمح العلامات الحامض الأميني تتكون من ستة بقايا الحامض الأميني على التوالي إلحاق إلى N-أو ج-المحطة بروتين المؤتلف تنقية السريع بتقارب معدنية اللوني4،،من56. تسلسل هذه صغيرة مقارنة بالبروتينات تعديلها، وعادة ما يكون له تأثير ضئيل على وظيفة البروتين، على الرغم من أنها يمكن أن تغير في بعض الأحيان الاستقرار البروتين و/أو إنزيم حركية7،8. يمكن أن يكون الحامض الأميني العلامات في ن-وج-تيرميني للبروتين نفس تأثيرات مختلفة، والتي يصعب التنبؤ بها دون معرفة هيكل البروتين في السؤال. وأدرجت العلامات الحامض الأميني عادة أثناء استنساخ بروتين المؤتلف بتصميم كبسولة تفجير ترميز ستة الحامض الأميني البقايا، أما فورا 3 ‘إلى كودون بدء ATG أو فورا 5’ إلى كودون وقف الإطار القراءة المفتوحة. بعد التضخيم، متصلة إلى ناقل تحت سيطرة مروج إيندوسيبلي الجينات المحتوية على هيكساهيستيديني وأعرب عادة في مختبر سلالة كولاي. ثم يمكن أن تكون معزولة جزئ البروتين راتنج تقارب المحتوية على الكاتيونات divalent المعطل تداولها (عادة من النيكل أو الكوبالت)9. يمكن إزالة تلويث الأصلية ملزمة معدنية البروتينات بالمعايرة مع ايميدازول، الذي يزيح تنافسية البروتين ملزمة2. وأخيراً، هو التيد البروتين المستهدف من العمود مع تركيزات أعلى من ايميدازول. هناك عدة مصادر تجارية الراتنجات الموجبة معدنية المعطل تداولها، والشركات المصنعة تقديم توصيات بشأن شروط المخزن المؤقت وتركيزات ايميدازول. بعد شطف، يمكن تحليلها بواسطة الصوديوم دوديسيل كبريتات-polyacrylamide هلام التفريد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة) البروتين أو دياليزيد أو استخدامها على الفور في الاختبارات الوظيفية.
هناك عدة طرق لمراقبة النشاط كيناز غير مباشر باقتران التحلل بوند الفوسفات ATP إلى رد فعل ثاني الذي يثير فلوروفوري أو النشرات أو يولد تشيميلومينيسسينسي، ولكن ردود الفعل هذه لها عدة أجزاء متحركة، ويمكن أن تكون 10من الناحية اللوجستية الصعبة. الطريقة الأكثر مباشرة لقياس نشاط نقل الفوسفور على وجه التحديد مباشرة رصد نقل مجموعة الفوسفات راديولابيليد من المتاحة تجارياً γ-32-P السلائف NTP للركيزة غير راديولابيليد11 , 12 , 13-يمكن فصل خليط من ركائز راديولابيليد والمنتجات وكمياً بطبقة رقيقة اللوني (TLC). ويستخدم TLC تفاضلية تنقل الذوائب في مذيب معين عن طريق السماح المذيبات (الطور السائل) ترحيل بعمل شعري عبر سطح (المرحلة الصلبة) التي كانت مزيجاً الذوائب الممتزة14. سيتم ترحيل الذوائب الصغيرة و/أو تفتقر إلى تفاعلات إيجابية مع المرحلة الصلبة مسافات أطول من مواقعها الأولية من الذوائب مع الأوزان الجزيئية أعلى أو الانتماءات كبيرة الصلبة. لدراسة نقل الفوسفور، مويتيس الفوسفات زيادة الوزن الجزيئي للجزيئات أنها تضاف إلى، وإضافة تهمة الأيونية السالبة في الأس الهيدروجيني المحايدة أو الحمضية11،،من1214. هذا يقلل من قدرتها على الحركة على سطح أساسية مثل السيلولوز بي. عندما وضعت في المخزن المؤقت لفوسفات البوتاسيوم الحمضية، يمكن فصل المخاليط مونو-دي-، ثلاثي، رباعي، والأنواع بينتافوسفاتي سهولة في بي-السليلوز، السماح للتحديد الكمي لكل نوع من الأنواع (الشكل 2، الشكل 3). يمكن إجراء هذه الاختبارات باستخدام ليساتيس الخلية التي تحتوي على الإنزيم للفائدة، ولكن هذا يشمل احتمال نشاط أخرى مؤنزم، فوسفاتاسيس، وأتباسيس العامة لاستنزاف الركيزة و/أو المنتج. تقييم كمي في المختبر لنشاط إنزيم، من الضروري تنقية إنزيم الفائدة.
جوانوسيني تيترافوسفاتي (بجب) وجوانوسيني بينتافوسفاتي (ببجب) ريبونوكليوتيدي إشارات الجزيئات التي شكلتها نقل بيروفوسفات المجموعة من سلائف الادينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP)، على التوالي، guanosine diphosphate (الناتج المحلي الإجمالي) أو جانسين الركيزة تيترافوسفاتي (غتب)15. هذه الإشارات ريبونوكليوتيدي واحد، المعروفة ببجب (p)، التوسط استجابة على مستوى الخلية للإجهاد البيئي المعروف باسم الاستجابة الصارمة في الأنواع البكتيرية المتنوعة15،16. فئتين مصانة من الإنزيمات تحفيز التشكيل (ف) بجب15،17 Rel/مكتب التخطيط الاستراتيجي الإنزيمات هومولوج (RSH) ‘طويلة’ بيفونكشونال (ف) بجب سينثاتيز/هيدرولاسيس اسمه للتشابه بهم إلى ريلى والفور (ف) بجب الأيضية إنزيمات من الإشريكيّة القولونية التي تحتوي على سينثاتيز هيدرولاز والمجالات التنظيمية، بينما الإنزيمات سينثاتيز (SAS) الارمون الصغيرة سينثيتاسيس مونوفونكشونال قصيرة وجدت حصرا في غرام البكتيريا إيجابية15، 17 , 18-بكتيريا إيجابية تشكيل بوغ المطثيّة العسيرة بترميز الجينات RSH و SAS المفترضة19. هنا، نحن نقدم فحوصات النشاط الأولية التي تؤكد أن الإنزيم RSH جيم سينثاتيز بجب (ف) حفازة نشطة.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا نحن تقرير تنقية RSH صاحب معلم من جيم وتقديم طريقة لتقدير حجم النشاط باستخدام كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة راديولابيليد. سابقا وقد استخدم هذا الأسلوب لتقييم نشاط الإنزيمات سيكلاسي ديجوانيلاتي من جيم، فضلا عن (ف) بجب سينثاتيز، cyclase النوكليوتيدات، كيناز والأنزيمات فوسفوديستري?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل من نييد 1K22AI118929-01. وأيد EBP “الصيف زمالة برنامج منحة بحثية” من “مكتب بحوث” جامعة القديمة دومينيون، نورفولك، فيرجينيا، الولايات المتحدة الأمريكية.
Materials
| Inducible overexpression of a histidine-tagged protein | |||
| Phusion polymerase | New England Biolabs (NEB) | M0530L | |
| QIAEX II DNA Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | |
| KpnI restriction enzyme | NEB | R0142S | |
| PstI restriction enzyme | NEB | R0140S | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202 | |
| NEB® 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) | NEB | C2987I | |
| BL21 (DE3) Competent E. coli | NEB | C2527I | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | 10724815001 | |
| JXN-26 centrifuge with JLA 10.500 rotor | Beckman Coulter Avanti | – | |
| Microcentrifuge with D3024/D3024R rotor | Scilogex | – | |
| MaxQ SHKE6000 Incubator | Thermo Scientific | – | |
| Ultrasonic processor | Sonics | VC-750 | |
| Protein purification by nickel affinity chromatography | |||
| Ni-NTA resin | G Biosciences | 786-940/941 | |
| Pierce Disposable Gravity columns, 10 mL | Thermo Scientific | 29924 | |
| 1 mL Spectra/ Por float-A-lyzer G2 dialysis device (MWCO: 20-kD) | Spectrum | G235033 | |
| Mini-Protean Electrophoresis Cell | BioRad | 1658004 | |
| Protein activity assay by thin layer chromatography | |||
| Thin layer chromatograph (TLC) development tank | General Glass Blowing Company | 80-3 | |
| Polyethylenimine (PEI)-cellulose plates (20 cm x 20 cm, 100 um thickness) with polyester support | Sigma-Aldrich | Z122882-25EA | |
| ATP, [γ-32P]- 3000 Ci/mmol 10mCi/ml lead, 100 μCi | Perkin Elmer | NEG002A | |
| Adenosine 5’-triphosphate (ATP) 100 mM | Bio Basic Canada | AB0311 | |
| Guanosine-5’-diphosphate disodium salt (GDP) | Alfa Aesar | AAJ61646MC/E | |
| Storage phosphor screen | GE Healthcare Life Sciences | BAS-IP TR 2040 E Tritium Screen | |
| Storm 860 phosphorimager | GE Healthcare Life Sciences | – |
References
- Cheek, S., Ginalski, K., Zhang, H., Grishin, N. V. A comprehensive update of the sequence and structure classification of kinases. BMC Structural Biology. 5 (1), 6 (2005).
- Porath, J. Immobilized metal ion affinity chromatography. Protein Expression and Purification. 3 (4), 263-281 (1992).
- Arnau, J., Lauritzen, C., Pedersen, J. Cloning strategy, production and purification of proteins with exopeptidase-cleavable His-tags. Nature Protocols. 1 (5), 2326-2333 (2006).
- Porath, J., Carlsson, J., Olsson, I., Belfrage, G. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature. 258 (5536), 598-599 (1975).
- Smith, M. C., Furman, T. C., Ingolia, T. D., Pidgeon, C. Chelating peptide-immobilized metal ion affinity chromatography. A new concept in affinity chromatography for recombinant proteins. Journal of Biological Chemistry. 263 (15), 7211-7215 (1988).
- Graslund, S., et al. Protein production and purification. Nature Methods. 5 (2), 135-146 (2008).
- Booth, W. T., et al. Impact of an N-terminal Polyhistidine Tag on Protein Thermal Stability. ACS Omega. 3 (1), 760-768 (2018).
- Thielges, M. C., Chung, J. K., Axup, J. Y., Fayer, M. D. Influence of histidine tag attachment on picosecond protein dynamics. Biochemistry. 50 (25), 5799-5805 (2011).
- Chaga, G. S. Twenty-five years of immobilized metal ion affinity chromatography: past, present and future. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 49 (1-3), 313-334 (2001).
- Ma, H., Deacon, S., Horiuchi, K. The challenge of selecting protein kinase assays for lead discovery optimization. Expert opinion on drug discovery. 3 (6), 607-621 (2008).
- Tamayo, R., Tischler, A. D., Camilli, A. The EAL domain protein VieA is a cyclic diguanylate phosphodiesterase. Journal of Biological Chemistry. 280 (39), 33324-33330 (2005).
- Purcell, E. B., McKee, R. W., McBride, S. M., Waters, C. M., Tamayo, R. Cyclic Diguanylate Inversely Regulates Motility and Aggregation in Clostridium difficile. Journal of Bacteriology. 194 (13), 3307-3316 (2012).
- Purcell, E. B., Tamayo, R. Identification and characterization of cyclic nucleotide phosphodiesterases. Methods in Molecular Biology. 1016, 235-243 (2013).
- Ross, P., et al. Control of cellulose synthesis Acetobacter xylinum. A unique guanyl oligonucleotide is the immediate activator of the cellulose synthase. Carbohydrate Research. 149 (1), 101-117 (1986).
- Potrykus, K., Cashel, M. (p)ppGpp: still magical?. Annual Review of Microbiology. 62, 35-51 (2008).
- Boutte, C. C., Crosson, S. Bacterial lifestyle shapes stringent response activation. Trends in Microbiology. 21 (4), 174-180 (2013).
- Nanamiya, H., et al. Identification and functional analysis of novel (p)ppGpp synthetase genes in Bacillus subtilis. Molecular Microbiology. 67 (2), 291-304 (2008).
- Gaca, A. O., et al. Basal Levels of (p)ppGpp in Enterococcus faecalis: the Magic beyond the Stringent Response. mBio. 4 (5), (2013).
- Sebaihia, M., et al. The multidrug-resistant human pathogen Clostridium difficile has a highly mobile, mosaic genome. Nature Genetics. 38 (7), 779-786 (2006).
- Gasteiger, E., et al. ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3784-3788 (2003).
- Purcell, E. B., et al. A nutrient-regulated cyclic diguanylate phosphodiesterase controls Clostridium difficile biofilm and toxin production during stationary phase. Infection and Immunity. , (2017).
- Mechold, U., Murphy, H., Brown, L., Cashel, M. Intramolecular Regulation of the Opposing (p)ppGpp Catalytic Activities of RelSeq, the Rel/Spo Enzyme from Streptococcus equisimilis. Journal of Bacteriology. 184 (11), 2878-2888 (2002).
- Dalebroux, Z. D., Svensson, S. L., Gaynor, E. C., Swanson, M. S. ppGpp Conjures Bacterial Virulence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74 (2), 171-199 (2010).
- Bartlett, J. G. Clostridium difficile: progress and challenges. Annals of the New York Academy of Sciences. 1213, 62-69 (2010).
- . . US Department of Health and Human Services. , (2013).
