浄化、体外(p) ppGppクロストリジウム ・ ディフィシルから合成酵素の活性
Summary
ここでは、放射性標識基質と酵素活性の生体外の試金する製品の薄層クロマトグラフィーによるヒスチジン ピロホスホキナーゼ酵素の浄化法について述べる.酵素活性測定法はキナーゼ、ヌクレオチド酸シクラーゼ、またはその機構を含むヌクレオチド三リン酸加水分解蛍光体移動反応に広く適用可能。
Abstract
酵素キナーゼとピロホスホキナーゼは、ヌクレオチド三リン酸前駆体から γ リン酸または β-γ ピロリン酸基をリン酸化製品を作成する基板に転送します。使用-p NTP 前駆体をラベル付けにより、γ-32のラジオグラフィによる基板の利用と製品の形成を同時にモニタリングします。薄層クロマトグラフィー (TLC) セルロース プレート上では、迅速な分離と基板と製品の定量法をことができます。アッセイの精製 (p) ppGpp 合成酵素のピロホスホキナーゼ活動に薄層クロマトグラフィーを利用するための方法を提案します。このメソッドは以前環状ヌクレオチド及び還元型酵素の活動の特性に使用されています、ヌクレオチドの三リン酸塩結合を加水分解するまたは端末に転送する酵素の活性の特性を広く適切ですリン酸リン酸ドナーから別の分子へ。
Introduction
キナーゼとピロホスホキナーゼ (または diphospho キナーゼ) の酵素はヌクレオチド三リン酸 (NTP) 前駆体から基質分子にリン酸塩を転送します。基板は他のヌクレオチド、アミノ酸や蛋白質、炭水化物および脂質1を含めることができます。酵素の同種基板や基板の特徴酵素に類似度に基づく情報の解析が予測できる時が、実験による検証が必要です。同様に、その substrate(s) のレートでそれは蛍光体転送反応を触媒する酵素の親和性と共同の要因、阻害剤、または他の酵素のエフェクタの効果は実験的決定する必要があります。その他の ATP 消費の酵素を細菌の細胞質に存在して ATP 前駆体の枯渇を避けるため、定量的活性アッセイは浄化された蛋白質を要求します。
金属アフィニ ティー ・ クロマトグラフィー蛋白質の浄化は、文献2,3徹底的に覆われています。N- または C 末端の組換え蛋白質を追加 6 連続ヒスチジン残基から成るヒスチジン タグは、金属親和性クロマトグラフィー4,5,6による急速な浄化を許可します。これらのシーケンスが彼らは時々、タンパク質の安定性や酵素反応速度論7、8を変更すること、彼らは変更し、タンパク質の機能にほとんど影響を持つ通常のタンパク質に比べて小さいです。ヒスチジン タグで N と C-末端同じ蛋白質の問題の蛋白質の構造を知らなくても予測することは困難である、さまざまな効果を持つことができます。ヒスチジンのタグは、通常ケーブルをどちらかすぐに六つのヒスチジン残基をエンコードのプライマーを設計することによって、3′ ATG 開始コドンにまたはすぐに 5′ 停止コドンに開いたリーディング ・ フレームの組換え蛋白質のクローン作成中に組み込まれています。増幅後、hexahistidine を含む遺伝子は誘導性プロモーターの制御の下でベクトルに、大腸菌の実験室で、通常表されます。組換えタンパク質は、固定化の二価陽イオン (通常ニッケルまたはコバルト)9を含む親和性の樹脂で分離できます。ネイティブ金属結合蛋白質の汚染は、競争力のある連結蛋白質2を転置するイミダゾールを滴定法によって削除できます。最後に、ターゲット蛋白質はイミダゾールの高濃度の列から溶離されます。固定化金属陽イオン樹脂のいくつかの商業源があるし、メーカーは、バッファー条件とイミダゾールの集中のための推奨事項を提供します。溶出後タンパク質ナトリウム dodecyl 硫酸塩-ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) を用いて、透析、または機能の試金ですぐに使用します。
ATP のリン酸結合の加水分解を解放または励起、蛍光、化学発光を生成します 2 番目の反応に結合することによって直接にキナーゼ活動を監視する方法はいくつかありますが、これらの反応は複数の可動部が、することができます。ロジスティック困難である10。特に蛍光体転送アクティビティを測定する最も簡単な方法は直接の監視から市販の γ-32radiolabeled リン酸基の転送 -P、非標識基板11に NTP 前駆体,12,13。 標識基板と製品の混合物を分離および薄層クロマトグラフィー (TLC) による定量化できます。TLC は、毛管作用によって、溶質の混合物の吸着14をされている表面 (固相) に移行する溶媒 (液相) により溶媒中の溶質の差分のモビリティを利用しています。小さいや固相との良好な相互作用が不足する溶質移行より高い分子量またはソリッドの偉大な親和性と溶質それぞれ初期の場所から長い距離。蛍光体転送の検討、リン酸基は彼らを追加する、中性または酸性 pH11,12,14負イオン電荷を追加分子の分子量を増やします。これは PEI セルロースなどの基本的な面で自分たちのモビリティを減らします。酸性カリウム リン酸バッファーに開発され、モノ、ジ、トリ、テトラ-、pentaphosphate 種の混合物は、PEI セルロース、(図 2 図 3) 各種の定量化を可能に容易に分離できます。関心の酵素を含むセル lysates を使用してこのようなアッセイを行うことが、これは基板や製品を破壊する他のキナーゼ、ホスファターゼ、および一般的な Atpase の活動の可能性を含まれています。酵素活性の定量の in vitro評価、関心の酵素を浄化するために必要です。
グアノシン四リン酸 (ppGpp) とグアノシン pentaphosphate (pppGpp) は、リボヌクレオチド シグナリング分子、ピロリン酸の移動によって形成されたグループ アデノシン三リン酸 (ATP) の前駆体から、それぞれ、グアノシン二リン酸 (GDP) またはグアノシン四リン酸 (GTP) 基板15。(P) ppGpp と総称するこれらの単一リボヌクレオチド信号は、多様な細菌種15,16で厳格な応答として知られている環境ストレスへのセル全体の応答を仲介します。形成を触媒する酵素の 2 つの保存されたクラス (p) ppGpp15,17 Rel/Spo の相同物 (RSH) 酵素が ‘long’ 二官能性 (p) ppGpp 合成酵素/加水分解酵素関連やスポット (p) が彼らの類似の名前 ppGpp 代謝小さな alarmone 合成酵素 (SAS) 酵素がグラム陽性菌15,排他的に見られる短い単シンテターゼ、合成酵素、加水分解酵素、および規制のドメインを含む大腸菌由来の酵素17,18. 胞子形成グラム陽性菌クロストリジウム ・ ディフィシルは、RSH と SAS の推定の遺伝子19をエンコードします。C. ディフィシルRSH 酵素が触媒活性を示す (p) ppGpp 合成酵素であることを確認する初期活性測定法を紹介します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで報告difficile C.から彼の付けられた RSH の浄化と radiolabeled 薄層クロマトグラフィーを用いた活動の定量化手法を提案します。このメソッドは、以前のdifficile C.、(p) ppGpp 合成酵素、ヌクレオチド酸シクラーゼ、キナーゼ diguanylate 酸シクラーゼ酵素と他の生物から11,12 ホスホジエステラーゼの酵素活性を評価するために使用されていま?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、NIAID 1K22AI118929-01 によって賄われていた。EBP はオールド ドミニオン大学、ノーフォーク、バージニア州、アメリカ合衆国での調査のオフィスから夏研究フェローシップ プログラム助成金によって支えられました。
Materials
| Inducible overexpression of a histidine-tagged protein | |||
| Phusion polymerase | New England Biolabs (NEB) | M0530L | |
| QIAEX II DNA Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | |
| KpnI restriction enzyme | NEB | R0142S | |
| PstI restriction enzyme | NEB | R0140S | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202 | |
| NEB® 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) | NEB | C2987I | |
| BL21 (DE3) Competent E. coli | NEB | C2527I | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | 10724815001 | |
| JXN-26 centrifuge with JLA 10.500 rotor | Beckman Coulter Avanti | – | |
| Microcentrifuge with D3024/D3024R rotor | Scilogex | – | |
| MaxQ SHKE6000 Incubator | Thermo Scientific | – | |
| Ultrasonic processor | Sonics | VC-750 | |
| Protein purification by nickel affinity chromatography | |||
| Ni-NTA resin | G Biosciences | 786-940/941 | |
| Pierce Disposable Gravity columns, 10 mL | Thermo Scientific | 29924 | |
| 1 mL Spectra/ Por float-A-lyzer G2 dialysis device (MWCO: 20-kD) | Spectrum | G235033 | |
| Mini-Protean Electrophoresis Cell | BioRad | 1658004 | |
| Protein activity assay by thin layer chromatography | |||
| Thin layer chromatograph (TLC) development tank | General Glass Blowing Company | 80-3 | |
| Polyethylenimine (PEI)-cellulose plates (20 cm x 20 cm, 100 um thickness) with polyester support | Sigma-Aldrich | Z122882-25EA | |
| ATP, [γ-32P]- 3000 Ci/mmol 10mCi/ml lead, 100 μCi | Perkin Elmer | NEG002A | |
| Adenosine 5’-triphosphate (ATP) 100 mM | Bio Basic Canada | AB0311 | |
| Guanosine-5’-diphosphate disodium salt (GDP) | Alfa Aesar | AAJ61646MC/E | |
| Storage phosphor screen | GE Healthcare Life Sciences | BAS-IP TR 2040 E Tritium Screen | |
| Storm 860 phosphorimager | GE Healthcare Life Sciences | – |
References
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