Een zuivering en In Vitro activiteit Assay voor een (p) ppGpp Synthetase van Clostridium difficile
Summary
Hier beschrijven we een methode voor de zuivering van histidine-gelabelde pyrophosphokinase enzymen en met behulp van Dunnelaagchromatografie van radioactief gelabelde substraten en producten voor de enzymatische activiteit in vitroassay. De enzym activiteit bepaling geldt in grote lijnen aan kinase, nucleotide cyclase, of fosfor-overdracht reactie waarvan mechanisme nucleotide trifosfaat hydrolyse omvat.
Abstract
Kinase en pyrophosphokinase enzymen overbrengen in de gamma-fosfaat of het beta-gamma pyrofosfaat deel van nucleotide trifosfaat precursors substraten gefosforyleerd producten te maken. Het gebruik van γ –32– P label NTP precursoren zorgt voor de gelijktijdige opvolging van substraat gebruik en product vorming door radiografie. Dunnelaagchromatografie (TLC) op cellulose platen kan snelle scheiding en gevoelige kwantificering van substraat en product. Presenteren we een methode voor het gebruik van de dunne-laag chromatografie te assay de pyrophosphokinase activiteit van een gezuiverde (p) ppGpp synthetase. Deze methode is eerder gebruikt voor het karakteriseren van de activiteit van cyclische nucleotide en dinucleotide synthetases en is in grote lijnen geschikt voor het karakteriseren van de activiteit van een enzym dat een nucleotide trifosfaat obligatie ontstabiel of overdraagt van een terminal fosfaat uit een fosfaat donor aan een andere molecule.
Introduction
Kinase en pyrophosphokinase (of diphospho-kinase) enzymen overbrengen fosfaten uit nucleotide trifosfaat (NTP) precursoren substraat moleculen. De substraten kunnen omvatten andere nucleotiden, aminozuren of eiwitten, koolhydraten en vetten1. Bioinformatic analyses kunnen soms voorspellen van een enzym cognaat substraat of substraten op basis van de gelijkenis met gekarakteriseerd enzymen experimentele validatie is echter nog steeds nodig. Ook de affiniteit van een enzym voor haar substrate(s) en het tarief waartegen het katalyseert de fosfor-overdracht-reactie, en de effecten van cofactoren, remmers, of andere enzym effectoren moeten experimenteel worden bepaald. Kwantitatieve activiteit testen vereisen om te voorkomen dat de uitputting van de voorloper van de ATP door andere ATP-verbruikende enzymen aanwezig in bacteriële cytoplasma, gezuiverde eiwit.
Eiwitreiniging door metalen affiniteitchromatografie is grondig gecoverd in de literatuur2,3. Histidine tags bestaande uit zes opeenvolgende histidine residuen toegevoegd aan de N – of C-terminus van een recombinant eiwit toestaan snelle zuivering door metal affinity chromatografie4,5,6. Deze sequenties zijn klein in vergelijking met de eiwitten ze wijzigen en hebben meestal een minimaal effect op eiwitfunctie, hoewel ze soms eiwitstabiliteit en/of enzyme kinetics7,8kunnen wijzigen. Histidine tags op de N – en C-termini van hetzelfde eiwit kunnen verschillende gevolgen hebben, die moeilijk te voorspellen, zonder de structuur van het eiwit in kwestie. Histidine tags zijn meestal tijdens het klonen van een recombinant eiwit door het ontwerpen van inleidingen die zes histidine residuen, ofwel onmiddellijk coderen 3′ aan de ATG start codon of onmiddellijk 5′ naar de stop codon van het open leesraam opgenomen. Na versterking, is het gen hexahistidine-bevattende afgebonden in een vector onder de controle van een afleidbare promotor en uitgedrukt, meestal in een laboratorium stam van E. coli. Het eiwit recombinatie kan vervolgens worden geïsoleerd op een hars van de affiniteit met daarin geïmmobiliseerdet divalente kationen (meestal nikkel of kobalt)9. Besmetting van inheemse metaal-bindende proteïnen kan worden verwijderd door titratie met imidazool, die concurrerend afhankelijke eiwitten2 verdringt. Ten slotte is het doel eiwit uit de kolom met hogere concentraties van imidazool geëlueerd. Er zijn verschillende commerciële bronnen voor geïmmobiliseerdet metalen catie harsen en de fabrikanten bieden aanbevelingen voor de buffer voorwaarden en imidazol concentraties. Na elutie, kan eiwit worden geanalyseerd door natrium dodecyl sulfaat-polyacrylamide gelelektroforese (SDS-pagina), dialyzed of onmiddellijk gebruikt in functionele testen.
Er zijn verschillende methoden om niet indirect kinaseactiviteit controleren door de hydrolyse van ATP fosfaat bond koppelen aan een tweede reactie die loslaat of een fluorophore opwekt of Chemoluminescentie genereert, maar deze reacties hebben meerdere bewegende delen en kan logistiek uitdagende10. De eenvoudigste manier om te meten specifiek fosfor-overdracht activiteit is rechtstreeks volgen de overdracht van een radiolabeled fosfaatgroep van een commercieel beschikbare γ –32-P NTP voorloper van een niet-radiolabeled substraat11 , 12 , 13. mengsels van radiolabeled substraten en producten kunnen worden gescheiden en gekwantificeerd door de dunne laag chromatografie (TLC). TLC maakt gebruik van de differentiële mobiliteit van opgeloste stoffen in een bepaald oplosmiddel doordat het oplosmiddel (vloeibare fase) migreren door capillaire actie over een oppervlak (vaste fase) waarop een mengsel van opgeloste stoffen geadsorbeerde14is geweest. Opgeloste stoffen die zijn klein en/of gebrek aan gunstige interactie met de vaste fase zal migreren langere afstanden vanaf hun oorspronkelijke locatie dan opgeloste stoffen met een hoger molecuulgewicht of grote affiniteit voor de vaste stof. Voor de bestudering van fosfor-overdracht, fosfaat wordt verhoogd het molecuulgewicht van moleculen ze worden toegevoegd aan, en voeg negatieve Ionische lading aan neutrale of zure pH11,12,14. Dit vermindert hun mobiliteit op een fundamentele oppervlak zoals PEI-gemengd met cellulose. Wanneer ontwikkeld in zure kalium fosfaatbuffer, kunnen de mengsels van mono-, di-, tri-, tetra- en pentaphosphate soorten gemakkelijk worden gescheiden op PEI-cellulose, waardoor kwantificering van elke soort (Figuur 2, figuur 3). Dergelijke tests kunnen worden uitgevoerd met behulp van cel lysates met het enzym van belang, maar hierbij het potentieel voor de activiteit van andere kinases, fosfatasen genaamd, en algemene ATPasen aan het uitputten van het substraat en/of product. Een kwantitatieve in vitro beoordelingvan enzymactiviteit is het noodzakelijk voor het zuiveren van het enzym van belang.
Calciumguanosine tetraphosphate (ppGpp) en calciumguanosine pentaphosphate (pppGpp) zijn ribonucleotide signalering moleculen gevormd door de overdracht van een pyrofosfaat groep uit een voorloper van adenosinetrifosfaat (ATP) aan, respectievelijk, een calciumguanosine difosfaat (BBP) of calciumguanosine tetraphosphate (GTP) substraat15. Deze interne ribonucleotide signalen, gezamenlijk bekend als (p) ppGpp, bemiddelen een cel-brede reactie op milieudruk bekend als de strenge reactie in verschillende bacteriesoorten15,16. Twee geconserveerde klassen van enzymen katalyseren de vorming van (p) ppGpp15,17 Rel/Spo homolog (RSH) enzymen zijn ‘lang’ bifunctionele (p) ppGpp synthetase/hydrolases is vernoemd naar hun gelijkenis met de EXTE en SpoT (p) ppGpp metabole enzymen van Escherichia coli die bevatten synthetase, hydrolase en regelgevende domeinen, terwijl kleine alarmone synthetase (SAS) enzymen korte monofunctional synthetases gevonden uitsluitend in Gram positieve bacteriën15, zijn 17 , 18. de spore-vormende gram-positieve bacterie Clostridium difficile codeert putatief RSH en SAS genen19. Hier presenteren we testen van de eerste activiteit die bevestigen dat de C. difficile RSH-enzym een catalytically actieve (p) ppGpp synthetase is.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier melden we de zuivering van zijn-gelabeld RSH van C. difficile en presenteer een methode voor de kwantificering van de activiteit met behulp van radiolabeled Dunnelaagchromatografie. Deze methode is eerder gebruikt om de activiteiten beoordelen van diguanylate cyclase enzymen van C. difficile, evenals (p) ppGpp synthetase, nucleotide cyclase, kinase en fosfodiësterase enzymen uit andere organismen11,12 ,13</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door NIAID 1K22AI118929-01. EBP werd gesteund door een subsidie van zomer Research Fellowship programma uit de Office of Research bij Old Dominion University, Norfolk, Virginia, Verenigde Staten.
Materials
| Inducible overexpression of a histidine-tagged protein | |||
| Phusion polymerase | New England Biolabs (NEB) | M0530L | |
| QIAEX II DNA Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | |
| KpnI restriction enzyme | NEB | R0142S | |
| PstI restriction enzyme | NEB | R0140S | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202 | |
| NEB® 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) | NEB | C2987I | |
| BL21 (DE3) Competent E. coli | NEB | C2527I | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | 10724815001 | |
| JXN-26 centrifuge with JLA 10.500 rotor | Beckman Coulter Avanti | – | |
| Microcentrifuge with D3024/D3024R rotor | Scilogex | – | |
| MaxQ SHKE6000 Incubator | Thermo Scientific | – | |
| Ultrasonic processor | Sonics | VC-750 | |
| Protein purification by nickel affinity chromatography | |||
| Ni-NTA resin | G Biosciences | 786-940/941 | |
| Pierce Disposable Gravity columns, 10 mL | Thermo Scientific | 29924 | |
| 1 mL Spectra/ Por float-A-lyzer G2 dialysis device (MWCO: 20-kD) | Spectrum | G235033 | |
| Mini-Protean Electrophoresis Cell | BioRad | 1658004 | |
| Protein activity assay by thin layer chromatography | |||
| Thin layer chromatograph (TLC) development tank | General Glass Blowing Company | 80-3 | |
| Polyethylenimine (PEI)-cellulose plates (20 cm x 20 cm, 100 um thickness) with polyester support | Sigma-Aldrich | Z122882-25EA | |
| ATP, [γ-32P]- 3000 Ci/mmol 10mCi/ml lead, 100 μCi | Perkin Elmer | NEG002A | |
| Adenosine 5’-triphosphate (ATP) 100 mM | Bio Basic Canada | AB0311 | |
| Guanosine-5’-diphosphate disodium salt (GDP) | Alfa Aesar | AAJ61646MC/E | |
| Storage phosphor screen | GE Healthcare Life Sciences | BAS-IP TR 2040 E Tritium Screen | |
| Storm 860 phosphorimager | GE Healthcare Life Sciences | – |
References
- Cheek, S., Ginalski, K., Zhang, H., Grishin, N. V. A comprehensive update of the sequence and structure classification of kinases. BMC Structural Biology. 5 (1), 6 (2005).
- Porath, J. Immobilized metal ion affinity chromatography. Protein Expression and Purification. 3 (4), 263-281 (1992).
- Arnau, J., Lauritzen, C., Pedersen, J. Cloning strategy, production and purification of proteins with exopeptidase-cleavable His-tags. Nature Protocols. 1 (5), 2326-2333 (2006).
- Porath, J., Carlsson, J., Olsson, I., Belfrage, G. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature. 258 (5536), 598-599 (1975).
- Smith, M. C., Furman, T. C., Ingolia, T. D., Pidgeon, C. Chelating peptide-immobilized metal ion affinity chromatography. A new concept in affinity chromatography for recombinant proteins. Journal of Biological Chemistry. 263 (15), 7211-7215 (1988).
- Graslund, S., et al. Protein production and purification. Nature Methods. 5 (2), 135-146 (2008).
- Booth, W. T., et al. Impact of an N-terminal Polyhistidine Tag on Protein Thermal Stability. ACS Omega. 3 (1), 760-768 (2018).
- Thielges, M. C., Chung, J. K., Axup, J. Y., Fayer, M. D. Influence of histidine tag attachment on picosecond protein dynamics. Biochemistry. 50 (25), 5799-5805 (2011).
- Chaga, G. S. Twenty-five years of immobilized metal ion affinity chromatography: past, present and future. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 49 (1-3), 313-334 (2001).
- Ma, H., Deacon, S., Horiuchi, K. The challenge of selecting protein kinase assays for lead discovery optimization. Expert opinion on drug discovery. 3 (6), 607-621 (2008).
- Tamayo, R., Tischler, A. D., Camilli, A. The EAL domain protein VieA is a cyclic diguanylate phosphodiesterase. Journal of Biological Chemistry. 280 (39), 33324-33330 (2005).
- Purcell, E. B., McKee, R. W., McBride, S. M., Waters, C. M., Tamayo, R. Cyclic Diguanylate Inversely Regulates Motility and Aggregation in Clostridium difficile. Journal of Bacteriology. 194 (13), 3307-3316 (2012).
- Purcell, E. B., Tamayo, R. Identification and characterization of cyclic nucleotide phosphodiesterases. Methods in Molecular Biology. 1016, 235-243 (2013).
- Ross, P., et al. Control of cellulose synthesis Acetobacter xylinum. A unique guanyl oligonucleotide is the immediate activator of the cellulose synthase. Carbohydrate Research. 149 (1), 101-117 (1986).
- Potrykus, K., Cashel, M. (p)ppGpp: still magical?. Annual Review of Microbiology. 62, 35-51 (2008).
- Boutte, C. C., Crosson, S. Bacterial lifestyle shapes stringent response activation. Trends in Microbiology. 21 (4), 174-180 (2013).
- Nanamiya, H., et al. Identification and functional analysis of novel (p)ppGpp synthetase genes in Bacillus subtilis. Molecular Microbiology. 67 (2), 291-304 (2008).
- Gaca, A. O., et al. Basal Levels of (p)ppGpp in Enterococcus faecalis: the Magic beyond the Stringent Response. mBio. 4 (5), (2013).
- Sebaihia, M., et al. The multidrug-resistant human pathogen Clostridium difficile has a highly mobile, mosaic genome. Nature Genetics. 38 (7), 779-786 (2006).
- Gasteiger, E., et al. ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3784-3788 (2003).
- Purcell, E. B., et al. A nutrient-regulated cyclic diguanylate phosphodiesterase controls Clostridium difficile biofilm and toxin production during stationary phase. Infection and Immunity. , (2017).
- Mechold, U., Murphy, H., Brown, L., Cashel, M. Intramolecular Regulation of the Opposing (p)ppGpp Catalytic Activities of RelSeq, the Rel/Spo Enzyme from Streptococcus equisimilis. Journal of Bacteriology. 184 (11), 2878-2888 (2002).
- Dalebroux, Z. D., Svensson, S. L., Gaynor, E. C., Swanson, M. S. ppGpp Conjures Bacterial Virulence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74 (2), 171-199 (2010).
- Bartlett, J. G. Clostridium difficile: progress and challenges. Annals of the New York Academy of Sciences. 1213, 62-69 (2010).
- . . US Department of Health and Human Services. , (2013).
