ב חוץ גופית Assay פעילות עבור ppGpp (p) המעביר מ Clostridium difficile וטיהור
Summary
כאן, אנו מתארים שיטה לטיהור מתויג היסטידין pyrophosphokinase אנזימים וניצול כרומטוגרפיה שכבה דקה של סובסטרטים radiolabelled ומוצרים כדי assay עבור פעילות אנזימטי בתוך חוץ גופית. וזמינותו פעילות האנזים ישימה בהרחבה על כל קינאז, נוקלאוטיד cyclase או התגובה פוספור-העברת מנגנון אשר כולל נוקלאוטיד טריפוספט הידרוליזה.
Abstract
אנזימים קינאז, pyrophosphokinase העברה של פוספט גמא או את moiety רב-תכליתי בטא-גמא של נוקלאוטיד טריפוספט מבשרי סובסטרטים ליצירת מוצרים phosphorylated. השימוש של γ –32– P שכותרתו NTP מבשרי מאפשר פיקוח סימולטני של ניצול המצע היווצרות המוצר על-ידי רדיוגרפיה. שכבה דקה כרומטוגרפיה (TLC) על צלחות תאית מאפשרת כימות רגיש של המצע והמוצר והגליונות מהירה. אנו מציגים שיטה ניצול של כרומטוגרפיה דק-שכבה כדי assay לפעילות pyrophosphokinase המעביר ppGpp מטוהרים (p). שיטה זו כבר בעבר בשימוש כדי לאפיין את פעילות מחזורית synthetases נוקלאוטיד, dinucleotide ומתאים בהרחבה אפיון הפעילות של כל אנזים הידרוליזה ערבות טריפוספט נוקלאוטיד או מעביר מסוף פוספט מתורם פוספט כדי מולקולה נוספת.
Introduction
אנזימים קינאז, pyrophosphokinase (או diphospho-קינאז) להעביר פוספטים מבשרי טריפוספט (NTP) נוקלאוטיד המצע מולקולות. מצעים באפשרותך לכלול אחרים נוקלאוטידים, חומצות אמינו או חלבונים, פחמימות, שומנים1. ניתוחים Bioinformatic יכול לפעמים לחזות המצע cognate של אנזים או מצעים על סמך הדמיון כדי אנזימים מאופיין, אך אימות ניסיוני עדיין נחוץ. באופן דומה, בזיקה של אנזים substrate(s) שלו ואת הקצב שבו זה מזרז את התגובה פוספור-העברה, ואת ההשפעות של גורמים שותפים, מעכבי, או effectors אנזימים אחרים. להיקבע השפעול. כדי למנוע דלדול של מבשר ATP על ידי אחרים הצורכים ATP אנזימים המצויים הציטופלסמה חיידקי, פעילות כמותיים מבחני דורשים חלבון מטוהרים.
חלבון טיהור באמצעות כרומטוגרפיית זיקה מתכת כבר מכוסה באופן יסודי של ספרות2,3. תגיות היסטידין בהיקף של שישה שאריות היסטידין רצופים מצורף ל N – או C-הסופית של חלבון רקומביננטי מאפשרות טיהור מהירה זיקה מתכת כרומטוגרפיה4,5,6. רצפים אלה הם קטנים לעומת החלבונים הם לשנות, בדרך כלל יש השפעה מינימלית על פונקציה של חלבונים, למרות שהם יכולים לפעמים לשנות יציבות החלבון ו/או אנזים קינטיקה7,8. היסטידין תגים ב- N -, C-טרמיני של החלבון אותו יכול לקבל אפקטים שונים, אשר קשה לחזות מבלי להכיר את המבנה של החלבון המדובר. תגיות היסטידין משולבים בדרך כלל במהלך שכפול של חלבון רקומביננטי על-ידי עיצוב תחל זה לקודד את שאריות היסטידין 6, גם מיד 3′ כדי codon התחלה ATG או מיידית 5′ ל stop codon של מסגרת קריאה פתוחה. לאחר הגברה, הגן המכיל hexahistidine מאתרים לתוך וקטור תחת השליטה של יזם inducible, ביטוי, בדרך כלל זן מעבדה של e. coli. אז יכול להיות מבודדת החלבון רקומבינציה על שרף זיקה המכיל קיבוע קטיונים דו ערכיים (בדרך כלל ניקל או קובלט)9. ניתן להסיר מזהמות יליד המתכת מחייב חלבונים על ידי טיטור עם imidazole, אשר והשמה מזיחה חלבון מאוגד2. בסופו של דבר, חלבון המטרה הוא eluted מן העמודה עם ריכוז גבוה של imidazole. ישנם כמה מקורות מסחריים עבור קיבוע הקטיון מתכת שרפים, היצרנים לספק המלצות כדי להפוך את מאגר תנאים imidazole ריכוזים. לאחר • תנאי, חלבון יכול להיות נותחו על ידי נתרן dodecyl סולפט-לזיהוי בג’ל (מרחביות-עמוד), דיאליזה או מיד בשימוש מבחני פונקציונלי.
ישנן מספר שיטות לפיקוח פעילות קינאז בעקיפין על ידי צימוד הידרוליזה בונד פוספט ATP ריאקציה השנייה משחררת או מרגש fluorophore או יוצרת chemiluminescence, אבל תגובות אלו חלקים מרובים, ניתן יהיה לוגיסטית מאתגר10. הדרך הברור ביותר למדוד באופן ספציפי פוספור-העברת פעילות היא לפקח באופן ישיר ההעברה של קבוצת פוספט radiolabeled וγ זמינים מסחרית –32-P NTP קודמן המצע radiolabeled11 , 12 , 13. תערובות של סובסטרטים radiolabeled ומוצרים יכולים להיות מופרדים ו לכמת על ידי שכבה דקה כרומטוגרפיה (TLC). TLC מנצל את הניידות דיפרנציאלית של מומסים בגבול הממס נתון על-ידי מתן הממס (שלב נוזלי) להעביר על ידי נימיות על פני משטח (מעבדתי) שעליו היה תערובת של מומסים בגבול הספוחה14. מומסים בגבול קטנים ו/או חוסר אינטראקציה חיובית עם השלב מוצק נודדים למרחקים ארוכים ממיקומם הראשוני יותר מומסים בגבול עם משקל מולקולרי גבוה יותר או הזיקות נהדר עבור המוצק. בחינת פוספור-העברה, פוספט moieties להגדיל את המשקל המולקולרי של מולקולות הם מתווספים ולהוסיף מטען יוניים שלילי ב- pH נייטרלי או חומצי11,12,14. זה מקטין את הניידות שלהם על משטח בסיסיים כגון פיי-תאית. כשאתה פותח חומצי אשלגן פוספט מאגר, תערובות של מונו-, די-, tri-, טטרה- ו pentaphosphate מינים ניתן להפריד בקלות על פיי-תאית, המאפשר כימות של כל מין (איור 2, איור 3). מבחני כזה יכול להתבצע באמצעות lysates תאים המכילים את האנזים עניין, אבל זה כולל את פוטנציאל הפעילות של kinases אחרים, phosphatases ATPases כללי כדי לרוקן את המצע ו/או המוצר. עבור כמותיים במבחנה הערכה של פעילות אנזים, יש צורך לטהר את האנזים עניין.
Guanosine tetraphosphate (ppGpp) guanosine pentaphosphate (pppGpp) הם ribonucleotide איתות מולקולות נוצר על ידי העברת רב-תכליתי קבוצה של קודמן אדנוזין טריפוספט (ATP), בהתאמה, של diphosphate guanosine (תמ ג) או guanosine tetraphosphate (GTP) המצע15. אותות אלה ribonucleotide יחיד, המכונה באופן קולקטיבי (p) ppGpp, מתווכים ברמת התא בתגובה עקה המכונה תגובת מחמירים ב15,מגוונת מיני החיידקים16. שתי מחלקות ההכפלה של אנזימים לעודד היווצרות של15,ppGpp (p)17 Rel/Spo אנזימים homolog (RSH) הם ‘זמן’ bifunctional (p) ppGpp המעביר/hydrolases בשם שלהם דמיון רלה, ספוט (p) ppGpp מטבולית אנזימים של Escherichia coli אשר מכילים המעביר ההידרולז, תחומי הרגולציה, בעוד alarmone קטן המעביר (SAS) אנזימים synthetases monofunctional קצר נמצאו אך ורק גראם חיידקים חיוביים15, 17 , 18. יוצרי נבג גראם חיוביים החיידק Clostridium difficile מקודד בשם RSH ו- SAS הגנים19. כאן, אנו מציגים פעילות ראשונית מבחני לאשר כי האנזים RSH difficile ג הוא המעביר ppGpp catalytically פעיל (p).
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנחנו מדווחים הטיהור של שלו מתויג RSH מ ג difficile ולהציג שיטה על כימות פעילות באמצעות כרומטוגרפיה radiolabeled שכבה דקה. בעבר נעשה שימוש בשיטה זו כדי להעריך את הפעילות של אנזימים cyclase diguanylate ג difficile, כמו גם המעביר ppGpp (p), נוקלאוטיד cyclase, קינאז ואנזימים phosphodiesterase של האורגניזמים האחרים<sup class=…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומן על ידי NIAID 1K22AI118929-01. EBP נתמך על ידי מענק תוכנית הקיץ מלגת מחקר של משרד של המחקר באוניברסיטת דומיניון הישן, נורפולק, וירג’יניה, ארה ב.
Materials
| Inducible overexpression of a histidine-tagged protein | |||
| Phusion polymerase | New England Biolabs (NEB) | M0530L | |
| QIAEX II DNA Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | |
| KpnI restriction enzyme | NEB | R0142S | |
| PstI restriction enzyme | NEB | R0140S | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202 | |
| NEB® 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) | NEB | C2987I | |
| BL21 (DE3) Competent E. coli | NEB | C2527I | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | 10724815001 | |
| JXN-26 centrifuge with JLA 10.500 rotor | Beckman Coulter Avanti | – | |
| Microcentrifuge with D3024/D3024R rotor | Scilogex | – | |
| MaxQ SHKE6000 Incubator | Thermo Scientific | – | |
| Ultrasonic processor | Sonics | VC-750 | |
| Protein purification by nickel affinity chromatography | |||
| Ni-NTA resin | G Biosciences | 786-940/941 | |
| Pierce Disposable Gravity columns, 10 mL | Thermo Scientific | 29924 | |
| 1 mL Spectra/ Por float-A-lyzer G2 dialysis device (MWCO: 20-kD) | Spectrum | G235033 | |
| Mini-Protean Electrophoresis Cell | BioRad | 1658004 | |
| Protein activity assay by thin layer chromatography | |||
| Thin layer chromatograph (TLC) development tank | General Glass Blowing Company | 80-3 | |
| Polyethylenimine (PEI)-cellulose plates (20 cm x 20 cm, 100 um thickness) with polyester support | Sigma-Aldrich | Z122882-25EA | |
| ATP, [γ-32P]- 3000 Ci/mmol 10mCi/ml lead, 100 μCi | Perkin Elmer | NEG002A | |
| Adenosine 5’-triphosphate (ATP) 100 mM | Bio Basic Canada | AB0311 | |
| Guanosine-5’-diphosphate disodium salt (GDP) | Alfa Aesar | AAJ61646MC/E | |
| Storage phosphor screen | GE Healthcare Life Sciences | BAS-IP TR 2040 E Tritium Screen | |
| Storm 860 phosphorimager | GE Healthcare Life Sciences | – |
References
- Cheek, S., Ginalski, K., Zhang, H., Grishin, N. V. A comprehensive update of the sequence and structure classification of kinases. BMC Structural Biology. 5 (1), 6 (2005).
- Porath, J. Immobilized metal ion affinity chromatography. Protein Expression and Purification. 3 (4), 263-281 (1992).
- Arnau, J., Lauritzen, C., Pedersen, J. Cloning strategy, production and purification of proteins with exopeptidase-cleavable His-tags. Nature Protocols. 1 (5), 2326-2333 (2006).
- Porath, J., Carlsson, J., Olsson, I., Belfrage, G. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature. 258 (5536), 598-599 (1975).
- Smith, M. C., Furman, T. C., Ingolia, T. D., Pidgeon, C. Chelating peptide-immobilized metal ion affinity chromatography. A new concept in affinity chromatography for recombinant proteins. Journal of Biological Chemistry. 263 (15), 7211-7215 (1988).
- Graslund, S., et al. Protein production and purification. Nature Methods. 5 (2), 135-146 (2008).
- Booth, W. T., et al. Impact of an N-terminal Polyhistidine Tag on Protein Thermal Stability. ACS Omega. 3 (1), 760-768 (2018).
- Thielges, M. C., Chung, J. K., Axup, J. Y., Fayer, M. D. Influence of histidine tag attachment on picosecond protein dynamics. Biochemistry. 50 (25), 5799-5805 (2011).
- Chaga, G. S. Twenty-five years of immobilized metal ion affinity chromatography: past, present and future. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 49 (1-3), 313-334 (2001).
- Ma, H., Deacon, S., Horiuchi, K. The challenge of selecting protein kinase assays for lead discovery optimization. Expert opinion on drug discovery. 3 (6), 607-621 (2008).
- Tamayo, R., Tischler, A. D., Camilli, A. The EAL domain protein VieA is a cyclic diguanylate phosphodiesterase. Journal of Biological Chemistry. 280 (39), 33324-33330 (2005).
- Purcell, E. B., McKee, R. W., McBride, S. M., Waters, C. M., Tamayo, R. Cyclic Diguanylate Inversely Regulates Motility and Aggregation in Clostridium difficile. Journal of Bacteriology. 194 (13), 3307-3316 (2012).
- Purcell, E. B., Tamayo, R. Identification and characterization of cyclic nucleotide phosphodiesterases. Methods in Molecular Biology. 1016, 235-243 (2013).
- Ross, P., et al. Control of cellulose synthesis Acetobacter xylinum. A unique guanyl oligonucleotide is the immediate activator of the cellulose synthase. Carbohydrate Research. 149 (1), 101-117 (1986).
- Potrykus, K., Cashel, M. (p)ppGpp: still magical?. Annual Review of Microbiology. 62, 35-51 (2008).
- Boutte, C. C., Crosson, S. Bacterial lifestyle shapes stringent response activation. Trends in Microbiology. 21 (4), 174-180 (2013).
- Nanamiya, H., et al. Identification and functional analysis of novel (p)ppGpp synthetase genes in Bacillus subtilis. Molecular Microbiology. 67 (2), 291-304 (2008).
- Gaca, A. O., et al. Basal Levels of (p)ppGpp in Enterococcus faecalis: the Magic beyond the Stringent Response. mBio. 4 (5), (2013).
- Sebaihia, M., et al. The multidrug-resistant human pathogen Clostridium difficile has a highly mobile, mosaic genome. Nature Genetics. 38 (7), 779-786 (2006).
- Gasteiger, E., et al. ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3784-3788 (2003).
- Purcell, E. B., et al. A nutrient-regulated cyclic diguanylate phosphodiesterase controls Clostridium difficile biofilm and toxin production during stationary phase. Infection and Immunity. , (2017).
- Mechold, U., Murphy, H., Brown, L., Cashel, M. Intramolecular Regulation of the Opposing (p)ppGpp Catalytic Activities of RelSeq, the Rel/Spo Enzyme from Streptococcus equisimilis. Journal of Bacteriology. 184 (11), 2878-2888 (2002).
- Dalebroux, Z. D., Svensson, S. L., Gaynor, E. C., Swanson, M. S. ppGpp Conjures Bacterial Virulence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74 (2), 171-199 (2010).
- Bartlett, J. G. Clostridium difficile: progress and challenges. Annals of the New York Academy of Sciences. 1213, 62-69 (2010).
- . . US Department of Health and Human Services. , (2013).
