एक शुद्धि और इन विट्रो में गतिविधि परख के लिए एक (पी) ppGpp Synthetase से क्लोस्ट्रीडियम डिफीसाइल
Summary
यहां, हम शुद्ध histidine के लिए एक विधि का वर्णन-टैग pyrophosphokinase एंजाइमों और radiolabelled सब्सट्रेट और एंजाइमी गतिविधि के लिए परख करने के लिए उत्पादों की पतली परत क्रोमैटोग्राफी का उपयोग इन विट्रो में। एंजाइम गतिविधि परख मोटे तौर पर किसी भी कळेनासे, न्यूक्लियोटाइड cyclase, या फास्फोरस-हस्तांतरण प्रतिक्रिया जिसका तंत्र न्यूक्लियोटाइड ट्राइफॉस्फेट hydrolysis शामिल करने के लिए लागू है ।
Abstract
कळेनासे और pyrophosphokinase एंजाइम न्यूक्लियोटाइड उत्पादों को बनाने के लिए ट्राइफॉस्फेट phosphorylated पुरोगामी से गामा फॉस्फेट या बीटा-गामा pyrophosphate moiety को स्थानांतरित करते हैं । γ-३२-P लेबल NTP पुरोगामी का उपयोग रेडियोग्राफी द्वारा सब्सट्रेट उपयोग और उत्पाद गठन के एक साथ निगरानी की अनुमति देता है । पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी) फाइबर प्लेट पर तेजी से जुदाई और संवेदनशील सब्सट्रेट और उत्पाद की ठहराव की अनुमति देता है । हम एक शुद्ध (पी) ppGpp synthetase की pyrophosphokinase गतिविधि परख करने के लिए पतली परत क्रोमैटोग्राफी के उपयोग के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं । इस विधि पहले चक्रीय न्यूक्लियोटाइड और dinucleotide synthetases की गतिविधि की विशेषता के लिए इस्तेमाल किया गया है और एक hydrolyzes न्यूक्लियोटाइड बांड ट्राइफॉस्फेट या एक टर्मिनल स्थानांतरण कि किसी भी एंजाइम की गतिविधि निस्र्पक के लिए मोटे तौर पर उपयुक्त है फास्फेट एक फॉस्फेट दाता से दूसरे अणु के लिए ।
Introduction
कळेनासे और pyrophosphokinase (या diphospho-कळेनासे) एंजाइमों न्यूक्लियोटाइड ट्राइफॉस्फेट से फॉस्फेट स्थानांतरण (NTP) अग्रदूतों सब्सट्रेट अणुओं के लिए. सब्सट्रेट अन्य न्यूक्लियोटाइड, अमीनो एसिड या प्रोटीन, कार्बोहाइड्रेट, और लिपिड1शामिल कर सकते हैं । Bioinformatic जोडकर कभी-कभार एक एंजाइम के cognate सब्सट्रेट या सब्सट्रेट्स की विशेषता एंजाइमों की समानता के आधार पर भविष्यवाणी कर सकते हैं, लेकिन प्रयोगात्मक सत्यापन अभी भी आवश्यक है । इसी तरह, अपने सब्सट्रेट (एस के लिए एक एंजाइम के संबध) और दर जिस पर यह फास्फोरस catalyzes-स्थानांतरण प्रतिक्रिया, और सह कारकों के प्रभाव, अवरोधकों, या अन्य एंजाइम प्रभाव का निर्धारण किया जाना चाहिए प्रयोग. अंय एटीपी से एटीपी अग्रदूत साबित बैक्टीरिया कोशिका द्रव्य में मौजूद एंजाइमों की कमी से बचने के लिए, मात्रात्मक गतिविधि परख शुद्ध प्रोटीन की आवश्यकता है ।
धातु संबध क्रोमैटोग्राफी द्वारा प्रोटीन शुद्धिकरण साहित्य2,3में अच्छी तरह से कवर किया गया है । Histidine टैग लगातार छह Histidine अवशेषों से मिलकर N-या सी एक रिकॉमबिनेंट प्रोटीन की टर्मिनस के लिए संलग्न धातु संबध क्रोमैटोग्राफी4,5,6द्वारा तेजी से शुद्धि की अनुमति देते हैं । इन दृश्यों प्रोटीन वे संशोधित करने और आम तौर पर प्रोटीन समारोह पर एक न्यूनतम प्रभाव है की तुलना में छोटे हैं, हालांकि वे कभी-कभार प्रोटीन स्थिरता और/या एंजाइम कैनेटीक्स7,8बदल सकते हैं । एन पर Histidine टैग-और सी-टर्मिनी एक ही प्रोटीन के विभिंन प्रभाव है, जो सवाल में प्रोटीन की संरचना जाने के बिना भविष्यवाणी मुश्किल हो सकता है । Histidine टैग आमतौर पर एक रिकॉमबिनेंट प्रोटीन की क्लोनिंग प्राइमरों कि छह Histidine अवशेषों सांकेतिक शब्दों में बदलना, या तो तुरंत 3 ‘ ATG शुरू codon या तुरंत 5 ‘ के लिए खुला पढ़ने के फ्रेम के रोकने के codon के लिए शामिल हैं । प्रवर्धन के बाद, hexahistidine जीन युक्त एक वेक्टर में एक inducible प्रमोटर के नियंत्रण में ligated है और व्यक्त की है, आमतौर पर ई. कोलाईके एक प्रयोगशाला तनाव में । पुनर्संयोजन प्रोटीन तो एक समानता मैटीरियल divalent cations युक्त राल पर अलग किया जा सकता है (आमतौर पर निकल या कोबाल्ट)9। दूषित देशी धातु-बाध्यकारी प्रोटीन अनुमापन द्वारा imidazole के साथ हटाया जा सकता है, जो प्रतिस्पर्धी सीमित प्रोटीन2विस्थापित करता है । अंत में, लक्ष्य प्रोटीन imidazole के उच्च सांद्रता के साथ कॉलम से eluted है । वहां स्थिर धातु कटियन रेजिन के लिए कई वाणिज्यिक स्रोत हैं, और निर्माताओं बफर शर्तों और imidazole सांद्रता के लिए सिफारिशें प्रदान करते हैं । रेफरेंस के बाद, प्रोटीन सोडियम dodecyl सल्फेट-polyacrylamide जेल ट्रो (एसडीएस-PAGE), dialyzed, या कार्यात्मक परख में तुरंत इस्तेमाल किया द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है ।
वहां परोक्ष रूप से एक दूसरी प्रतिक्रिया है कि विज्ञप्ति या एक fluorophore उत्तेजित या chemiluminescence उत्पंन करने के लिए एटीपी फॉस्फेट बांड hydrolysis युग्मन द्वारा कळेनासे गतिविधि की निगरानी करने के लिए कई तरीके हैं, लेकिन इन प्रतिक्रियाओं कई चलती भागों है और हो सकता है रसद10चुनौतीपूर्ण । विशेष रूप से उपाय फास्फोरस-हस्तांतरण गतिविधि के लिए सबसे सरल तरीका सीधे एक गैर-radiolabeled सब्सट्रेट11 करने के लिए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध γ-३२-P NTP अग्रदूत से एक radiolabeled फॉस्फेट समूह के हस्तांतरण की निगरानी करने के लिए है , 12 , 13. radiolabeled सब्सट्रेट और उत्पादों का मिश्रण अलग किया जा सकता है और पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी) द्वारा quantified । टीएलसी विलायक (तरल चरण) एक सतह (ठोस चरण) है जिस पर solutes का मिश्रण14adsorbed किया गया है भर में केशिका कार्रवाई द्वारा विस्थापित करने की अनुमति देकर एक दिया विलायक में solutes के अंतर गतिशीलता का इस्तेमाल करता है । Solutes कि छोटे और/या ठोस चरण के साथ कमी अनुकूल बातचीत उच्च आणविक भार या ठोस के लिए महान समानताएं के साथ Solutes से अपने प्रारंभिक स्थान से अब दूरी की ओर पलायन होगा । फास्फोरस की परीक्षा के लिए-स्थानांतरण, फास्फेट moieties अणुओं वे करने के लिए जोड़ रहे हैं की आणविक वजन में वृद्धि, और तटस्थ या अंलीय पीएच11,12,14पर नकारात्मक ईओण चार्ज जोड़ने । इस तरह पी-फाइबर के रूप में एक बुनियादी सतह पर उनकी गतिशीलता कम हो जाती है । जब अंलीय पोटेशियम फॉस्फेट बफर में विकसित, मोनो के मिश्रण-, di-, त्रिकोणीय, टेट्रा-, और pentaphosphate प्रजातियों आसानी से पी-फाइबर पर अलग किया जा सकता है, प्रत्येक प्रजाति (चित्रा 2, चित्रा 3) के ठहराव की अनुमति. ऐसे परख सेल ब्याज के एंजाइम युक्त lysates का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन यह अंय kinases, phosphatases की गतिविधि के लिए क्षमता भी शामिल है, और सामांय ATPases सब्सट्रेट और/ के लिए एक मात्रात्मक में इन विट्रो एंजाइम गतिविधि का आकलन, यह ब्याज की एंजाइम को शुद्ध करने के लिए आवश्यक है.
Guanosine tetraphosphate (ppGpp) और Guanosine pentaphosphate (pppGpp) एक ribonucleotide pyrophosphate (एटीपी) के अग्रदूत से एक adenosine समूह के हस्तांतरण द्वारा गठित अणुओं संकेत ट्राइफॉस्फेट हैं, क्रमशः, एक Guanosine diphosphate (जीडीपी) या guanosine tetraphosphate (GTP) सब्सट्रेट15. इन एकल ribonucleotide संकेतों, सामूहिक रूप से (पी) ppGpp के रूप में जाना जाता है, पर्यावरण विविध जीवाणु प्रजातियों15,16में कड़े जवाब के रूप में जाना जाता तनाव के लिए एक सेल व्यापक प्रतिक्रिया मध्यस्थता । एंजाइमों के दो के संरक्षण वर्गों उत्प्रेरित (पी) के गठन के ppGpp15,17 रिलायंस एनर्जी/homolog (RSH) एंजाइमों ‘ लंबे ‘ है bifunctional (पी) ppGpp synthetase/hydrolases के लिए उनकी समानता के लिए नामांकित रिला और स्पॉट (पी) ppGpp चयापचय एंजाइमों ई कोलाई जिसमें synthetase, hydrolase, और विनियामक डोमेन होते हैं, जबकि छोटे alarmone synthetase (SAS) एंजाइमों लघु monofunctional synthetases में विशेष रूप से पाए जाते हैं ग्राम सकारात्मक बैक्टीरिया15, 17 , 18. बीजाणु बनाने वाले चने-पॉजिटिव जीवाणु क्लोस्ट्रीडियम डिफीसाइल encodes ख्यात RSH और एसएएस जीन19. यहां, हम प्रारंभिक गतिविधि परख कि पुष्टि करते है कि सी. डिफीसाइल RSH एंजाइम एक उत्प्रेरक सक्रिय (पी) ppGpp synthetase है वर्तमान ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां हम सी डिफीसाइल से अपने-टैग RSH की शुद्धि की रिपोर्ट और गतिविधि के लिए एक विधि वर्तमान radiolabeled पतली परत क्रोमैटोग्राफी का उपयोग कर ठहराव । इस विधि से पहले सी. डिफीसाइलसे diguanylate cyclase एंजाइमों की सक्रिय?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम NIAID 1K22AI118929-01 द्वारा वित्तपोषित था । EBP पुराने अधिराज्य विश्वविद्यालय, नॉरफ़ॉक, वर्जीनिया, संयुक्त राज्य अमेरिका में अनुसंधान के कार्यालय से एक ग्रीष्मकालीन अनुसंधान फैलोशिप कार्यक्रम अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Inducible overexpression of a histidine-tagged protein | |||
| Phusion polymerase | New England Biolabs (NEB) | M0530L | |
| QIAEX II DNA Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | |
| KpnI restriction enzyme | NEB | R0142S | |
| PstI restriction enzyme | NEB | R0140S | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202 | |
| NEB® 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) | NEB | C2987I | |
| BL21 (DE3) Competent E. coli | NEB | C2527I | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | 10724815001 | |
| JXN-26 centrifuge with JLA 10.500 rotor | Beckman Coulter Avanti | – | |
| Microcentrifuge with D3024/D3024R rotor | Scilogex | – | |
| MaxQ SHKE6000 Incubator | Thermo Scientific | – | |
| Ultrasonic processor | Sonics | VC-750 | |
| Protein purification by nickel affinity chromatography | |||
| Ni-NTA resin | G Biosciences | 786-940/941 | |
| Pierce Disposable Gravity columns, 10 mL | Thermo Scientific | 29924 | |
| 1 mL Spectra/ Por float-A-lyzer G2 dialysis device (MWCO: 20-kD) | Spectrum | G235033 | |
| Mini-Protean Electrophoresis Cell | BioRad | 1658004 | |
| Protein activity assay by thin layer chromatography | |||
| Thin layer chromatograph (TLC) development tank | General Glass Blowing Company | 80-3 | |
| Polyethylenimine (PEI)-cellulose plates (20 cm x 20 cm, 100 um thickness) with polyester support | Sigma-Aldrich | Z122882-25EA | |
| ATP, [γ-32P]- 3000 Ci/mmol 10mCi/ml lead, 100 μCi | Perkin Elmer | NEG002A | |
| Adenosine 5’-triphosphate (ATP) 100 mM | Bio Basic Canada | AB0311 | |
| Guanosine-5’-diphosphate disodium salt (GDP) | Alfa Aesar | AAJ61646MC/E | |
| Storage phosphor screen | GE Healthcare Life Sciences | BAS-IP TR 2040 E Tritium Screen | |
| Storm 860 phosphorimager | GE Healthcare Life Sciences | – |
References
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