En rensing og I Vitro aktivitet analysen for en (p) ppGpp Synthetase fra Clostridium difficile
Summary
Her beskriver vi en metode for rensing histidin-merket pyrophosphokinase enzymer og utnytte tynt lag kromatografi radiolabelled underlag og produkter til analysen for den enzymatiske aktiviteten i vitro. Enzym aktivitet analysen er bredt aktuelt noen kinase, nucleotide cyclase eller fosfor-transfer reaksjon som mekanisme inkluderer nukleotid trifosfat hydrolyse.
Abstract
Kinase og pyrophosphokinase enzymer overføre gamma-fosfat eller beta-gamma pyrophosphate moiety fra nukleotid trifosfat forløpere til underlag å lage fosforylert produkter. Bruk av γ –32– P merket NTP forløpere tillater samtidig overvåking av underlaget utnyttelse og produkt dannelsen av røntgenfotograferingen. Tynt lag kromatografi (TLC) på cellulose plater tillater rask separasjon og følsom kvantifisering av underlaget og produkt. Vi presenterer en metode for å utnytte den tynne lag kromatografi å analysen pyrophosphokinase aktiviteten til en renset (p) ppGpp synthetase. Denne metoden har tidligere blitt brukt til å beskrive aktiviteten av syklisk nukleotid og dinucleotide synthetases og er generelt egnet for karakteriserer aktiviteten til et enzym som hydrolyzes en nukleotid trifosfat obligasjon eller overfører en terminal fosfat fra fosfat giver til et annet molekyl.
Introduction
Kinase og pyrophosphokinase (eller diphospho-kinase) enzymer overføre fosfater fra nukleotid trifosfat (NTP) forløpere til underlaget molekyler. Substrater kan inneholde andre nukleotider, aminosyrer eller proteiner, karbohydrater og lipider1. Bioinformatic analyser kan noen ganger forutsi et enzym beslektet substrat eller underlag basert på likheten til preget enzymer, men eksperimentelle validering er fortsatt nødvendig. Tilsvarende affinitet av et enzym for sin substrate(s) og som det gir fosfor-transfer reaksjonen, og effekten av co-faktorer, hemmere, eller andre enzym effektor må avgjøres eksperimentelt. For å unngå uttømming av ATP forløperen av andre ATP tidkrevende enzymer i bakteriell cytoplasma, krever kvantitativ aktivitet analyser renset protein.
Protein rensing av metall affinitet kromatografi har blitt dekket grundig i litteratur2,3. Histidin tags bestående av seks påfølgende histidin rester lagt til N – eller C-terminus en rekombinant protein tillate rask rensing av metall affinitet kromatografi4,5,6. Disse sekvensene er små sammenlignet med proteiner de endre og har vanligvis en minimal effekt på protein funksjon, selv om de kan noen ganger endre protein stabilitet eller enzym kinetics7,8. Histidin koder på N – og C-jernbanestasjonen termini av samme protein kan ha ulike effekter, som er vanskelig å forutsi uten å vite strukturen av proteinet i spørsmålet. Histidin tags er vanligvis innlemmet under kloning av et rekombinant protein ved å utforme primere som kode seks histidin rester, enten umiddelbart 3′ til ATG start codon eller umiddelbart 5′ å stoppe codon åpent lesing rammen. Etter forsterkning, er hexahistidine inneholder genet samskrevet i en vektor under kontroll av en induserbart selskapet og uttrykt, vanligvis i et laboratorium stamme av E. coli. Rekombinasjon protein kan deretter bli isolert på en affinitet harpiks inneholder immobilisert divalent kasjoner (vanligvis nikkel eller kobolt)9. Forurensende opprinnelige metal-bindende proteiner kan fjernes ved titrering med imidazole, som konkurransedyktig fortrenger bundet protein2. Endelig er mål protein elut fra kolonnen med høyere konsentrasjoner av imidazole. Det er flere kommersielle kilder for immobilisert metall kation harpikser, og produsentene gir anbefalinger for bufferen betingelsene og imidazole konsentrasjoner. Etter elueringsrør, kan protein være analysert av natrium dodecyl sulfat-polyakrylamid gel geleelektroforese (SDS-side), dialyzed eller brukes umiddelbart i funksjonelle analyser.
Det er adskillige metoder å overvåke indirekte kinase aktivitet ved å koble ATP fosfat bond hydrolyse til en andre reaksjon som utgivelser interesserer en fluorophore eller genererer chemiluminescence, men disse reaksjonene har flere bevegelige deler og kan logistisk utfordrende10. Den enkleste måten å måle spesielt fosfor-datatransport aktivitet er å overvåke direkte overføring av radiolabeled fosfatgruppe fra en kommersielt tilgjengelig γ –32-P NTP forløperen til en ikke-radiolabeled substrat11 , 12 , 13. blandinger av radiolabeled underlag og produkter kan atskilt og kvantifisert ved tynt lag kromatografi (TLC). TLC benytter differensial mobilitet av solutes i et gitt løsemiddel ved å la løsemiddelet (flytende fase) overføre kapillær handling over en overflate (solid fase) som en blanding av solutes har vært adsorbert14. Solutes som er små og/eller mangler gunstige interaksjoner med solid fase vil migrere lengre avstander fra deres første sted enn solutes med høyere molekylvekt eller stor slektskap for solid. For undersøkelse av fosfor-overføring øke fosfat moieties molekylvekt molekyler de legges til, og legger til negativ ioniske nøytrale eller surt pH11,12,14. Dette reduserer mobilitet på en grunnleggende overflate som PEI-cellulose. Når utviklet i surt kalium fosfatbuffer, kan blandinger av mono – di-, tre-, tetra- og pentaphosphate Art lett skilles på PEI-cellulose, slik at kvantifisering av hver art (figur 2, figur 3). Slike analyser utføres med cellen lysates som inneholder enzymet rundt, men dette inkluderer potensialet for aktiviteten til andre kinaser, phosphatases og generell ATPases å utarme substrat og/eller produkt. For en kvantitativ i vitro vurdering av enzym aktivitet er det nødvendig å rense enzymet rundt.
Guanosine tetraphosphate (ppGpp) og guanosine pentaphosphate (pppGpp) er ribonucleotide signalnettverk molekyler som er dannet av overføring av en pyrophosphate gruppe fra en adenosin trifosfat (ATP)-forløperen til, henholdsvis en guanosine diphosphate (BNP) eller guanosine tetraphosphate (GTP) substrat15. Disse enkelt ribonucleotide signaler, kollektivt kjent som (p) ppGpp, formidle celle hele svar på miljøstress kjent som strenge svaret i bakteriell artsmangfoldet15,16. To bevarte klasser av enzymer katalysere dannelse (p) ppGpp15,17 Rel/Spo homolog (RSH) enzymer er ‘lang’ bifunctional (p) ppGpp synthetase/hydrolases oppkalt etter deres likhet til avslapning og SpoT (p) ppGpp metabolske enzymer fra Escherichia coli som inneholder synthetase, hydrolase og regulatoriske domener, mens små alarmone synthetase (SAS) enzymer er korte monofunctional synthetases funnet i Gram positiv bakterier15, 17 , 18. spore-forming Gram-positive bakterien Clostridium difficile koder antatte RSH og SAS gener19. Her presenterer vi første aktivitet analyser som bekrefter at C. difficile RSH enzymet er en katalytisk aktive (p) ppGpp synthetase.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her rapporterer vi rensing av hans-merket RSH fra C. difficile og presentere en metode for aktivitet kvantifisering bruker radiolabeled tynt lag kromatografi. Denne metoden har tidligere blitt brukt til å vurdere diguanylate cyclase enzymer fra C. difficile, samt nucleotide cyclase (p) ppGpp synthetase, kinase og fosfodiesterase enzymer fra andre organismer11,12 ,13,21. Meto…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble finansiert av NIAID 1K22AI118929-01. EBP ble støttet av en sommer forskning Fellowship Program stipend fra Office for forskning ved Old Dominion University i Norfolk, Virginia, USA.
Materials
| Inducible overexpression of a histidine-tagged protein | |||
| Phusion polymerase | New England Biolabs (NEB) | M0530L | |
| QIAEX II DNA Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | |
| KpnI restriction enzyme | NEB | R0142S | |
| PstI restriction enzyme | NEB | R0140S | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202 | |
| NEB® 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) | NEB | C2987I | |
| BL21 (DE3) Competent E. coli | NEB | C2527I | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | 10724815001 | |
| JXN-26 centrifuge with JLA 10.500 rotor | Beckman Coulter Avanti | – | |
| Microcentrifuge with D3024/D3024R rotor | Scilogex | – | |
| MaxQ SHKE6000 Incubator | Thermo Scientific | – | |
| Ultrasonic processor | Sonics | VC-750 | |
| Protein purification by nickel affinity chromatography | |||
| Ni-NTA resin | G Biosciences | 786-940/941 | |
| Pierce Disposable Gravity columns, 10 mL | Thermo Scientific | 29924 | |
| 1 mL Spectra/ Por float-A-lyzer G2 dialysis device (MWCO: 20-kD) | Spectrum | G235033 | |
| Mini-Protean Electrophoresis Cell | BioRad | 1658004 | |
| Protein activity assay by thin layer chromatography | |||
| Thin layer chromatograph (TLC) development tank | General Glass Blowing Company | 80-3 | |
| Polyethylenimine (PEI)-cellulose plates (20 cm x 20 cm, 100 um thickness) with polyester support | Sigma-Aldrich | Z122882-25EA | |
| ATP, [γ-32P]- 3000 Ci/mmol 10mCi/ml lead, 100 μCi | Perkin Elmer | NEG002A | |
| Adenosine 5’-triphosphate (ATP) 100 mM | Bio Basic Canada | AB0311 | |
| Guanosine-5’-diphosphate disodium salt (GDP) | Alfa Aesar | AAJ61646MC/E | |
| Storage phosphor screen | GE Healthcare Life Sciences | BAS-IP TR 2040 E Tritium Screen | |
| Storm 860 phosphorimager | GE Healthcare Life Sciences | – |
References
- Cheek, S., Ginalski, K., Zhang, H., Grishin, N. V. A comprehensive update of the sequence and structure classification of kinases. BMC Structural Biology. 5 (1), 6 (2005).
- Porath, J. Immobilized metal ion affinity chromatography. Protein Expression and Purification. 3 (4), 263-281 (1992).
- Arnau, J., Lauritzen, C., Pedersen, J. Cloning strategy, production and purification of proteins with exopeptidase-cleavable His-tags. Nature Protocols. 1 (5), 2326-2333 (2006).
- Porath, J., Carlsson, J., Olsson, I., Belfrage, G. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature. 258 (5536), 598-599 (1975).
- Smith, M. C., Furman, T. C., Ingolia, T. D., Pidgeon, C. Chelating peptide-immobilized metal ion affinity chromatography. A new concept in affinity chromatography for recombinant proteins. Journal of Biological Chemistry. 263 (15), 7211-7215 (1988).
- Graslund, S., et al. Protein production and purification. Nature Methods. 5 (2), 135-146 (2008).
- Booth, W. T., et al. Impact of an N-terminal Polyhistidine Tag on Protein Thermal Stability. ACS Omega. 3 (1), 760-768 (2018).
- Thielges, M. C., Chung, J. K., Axup, J. Y., Fayer, M. D. Influence of histidine tag attachment on picosecond protein dynamics. Biochemistry. 50 (25), 5799-5805 (2011).
- Chaga, G. S. Twenty-five years of immobilized metal ion affinity chromatography: past, present and future. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 49 (1-3), 313-334 (2001).
- Ma, H., Deacon, S., Horiuchi, K. The challenge of selecting protein kinase assays for lead discovery optimization. Expert opinion on drug discovery. 3 (6), 607-621 (2008).
- Tamayo, R., Tischler, A. D., Camilli, A. The EAL domain protein VieA is a cyclic diguanylate phosphodiesterase. Journal of Biological Chemistry. 280 (39), 33324-33330 (2005).
- Purcell, E. B., McKee, R. W., McBride, S. M., Waters, C. M., Tamayo, R. Cyclic Diguanylate Inversely Regulates Motility and Aggregation in Clostridium difficile. Journal of Bacteriology. 194 (13), 3307-3316 (2012).
- Purcell, E. B., Tamayo, R. Identification and characterization of cyclic nucleotide phosphodiesterases. Methods in Molecular Biology. 1016, 235-243 (2013).
- Ross, P., et al. Control of cellulose synthesis Acetobacter xylinum. A unique guanyl oligonucleotide is the immediate activator of the cellulose synthase. Carbohydrate Research. 149 (1), 101-117 (1986).
- Potrykus, K., Cashel, M. (p)ppGpp: still magical?. Annual Review of Microbiology. 62, 35-51 (2008).
- Boutte, C. C., Crosson, S. Bacterial lifestyle shapes stringent response activation. Trends in Microbiology. 21 (4), 174-180 (2013).
- Nanamiya, H., et al. Identification and functional analysis of novel (p)ppGpp synthetase genes in Bacillus subtilis. Molecular Microbiology. 67 (2), 291-304 (2008).
- Gaca, A. O., et al. Basal Levels of (p)ppGpp in Enterococcus faecalis: the Magic beyond the Stringent Response. mBio. 4 (5), (2013).
- Sebaihia, M., et al. The multidrug-resistant human pathogen Clostridium difficile has a highly mobile, mosaic genome. Nature Genetics. 38 (7), 779-786 (2006).
- Gasteiger, E., et al. ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3784-3788 (2003).
- Purcell, E. B., et al. A nutrient-regulated cyclic diguanylate phosphodiesterase controls Clostridium difficile biofilm and toxin production during stationary phase. Infection and Immunity. , (2017).
- Mechold, U., Murphy, H., Brown, L., Cashel, M. Intramolecular Regulation of the Opposing (p)ppGpp Catalytic Activities of RelSeq, the Rel/Spo Enzyme from Streptococcus equisimilis. Journal of Bacteriology. 184 (11), 2878-2888 (2002).
- Dalebroux, Z. D., Svensson, S. L., Gaynor, E. C., Swanson, M. S. ppGpp Conjures Bacterial Virulence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74 (2), 171-199 (2010).
- Bartlett, J. G. Clostridium difficile: progress and challenges. Annals of the New York Academy of Sciences. 1213, 62-69 (2010).
- . . US Department of Health and Human Services. , (2013).
