Ex Vivo, modèle de Culture d’organes cornéenne pour la cicatrisation des études

Summary

Un protocole pour un ancien modèle de culture de cornée orgue vivo utile pour la cicatrisation des études est exposée. Ce système de modèle peut servir à évaluer les effets des agents pour favoriser la guérison régénératrice ou toxicité des médicaments dans un environnement 3D organisé de multicellulaire.

Abstract

La cornée a été utilisée intensivement comme système modèle pour étudier la cicatrisation des plaies. La capacité de générer et d’utiliser des cellules primaires de mammifères en deux dimensions (2D) et en trois dimensions (3D) culture a généré une mine de renseignements non seulement sur la biologie de la cornée, mais aussi sur la plaie, guérison, myofibroblastes biologie et la cicatrisation en général . L’objectif du protocole est un système de dosage pour quantifier les myofibroblastes développement, qui caractérise la cicatrisation. Nous démontrons un cornée orgue ex vivo modèle de culture à l’aide des yeux de cochon. Dans cette kératectomie antérieure enroulé, cornées encore dans le monde sont blessées avec une lame circulaire appelée un trépan. Un bouchon d’environ 1/3 de la cornée antérieure est supprimé y compris l’épithélium, la membrane basale et la partie antérieure du stroma. Après la blessure, cornées sont coupées du monde, montées sur un socle de collagène/agar et cultivées pendant deux semaines en milieu sans sérum complétée de vitamine c stabilisée pour augmenter la prolifération cellulaire et la sécrétion de la matrice extracellulaire par les fibroblastes résidents. Activation des myofibroblastes dans le stroma antérieur est évidente dans la cornée cicatrisée. Ce modèle peut être utilisé pour doser la fermeture de la plaie, le développement des myofibroblastes et marqueurs fibreuses et pour les études de toxicologie. En outre, les effets des inhibiteurs de petites molécules comme la transfection de siARN médiée par les lipides pour de gène peuvent être testées dans ce système.

Introduction

Cicatrisation de la cornée résultant de la blessure, un traumatisme ou une infection peut conduire à débiliter des opacités cornéennes et une cécité permanente. Ainsi, il y a un besoin essentiel d’identifier les voies qui peuvent être ciblés pour une intervention thérapeutique. Les options thérapeutiques actuelles sont limitées et consistent principalement en des greffes de cornée, qui ne sont pas accessibles aux patients à travers le monde. Tant humaines (Figure 1) et cornées animales peuvent être utilisées pour la 2D et la culture cellulaire 3D études^1,2. Cornées de cadavre humain ne convient pas pour la transplantation peuvent être obtenues auprès de banques de le œil ou banques de tissus centralisé (National Disease Research Interchange (NDRI)), et animaux yeux peut provenir d’un abattoir. Cellules épithéliales cornéennes primaires et plus récemment, les cellules endothéliales, fibroblastes stromales peuvent être isolées et cultivées de ces tissus pour la cicatrisation des plaies et des études de toxicologie^3,4,5. En plus de l’importance de comprendre les bases moléculaires de l’aveuglement des maladies oculaires, l’accessibilité des tissus et la capacité de cellules primaires de la culture a fait de la cornée un important système modèle pour l’étude. La cornée est idéale pour tester les effets des agents sur la cicatrisation de la cornée normale est transparente et de certains types de blessures créent opacités ou cicatrices fibreuses (évaluées à⁶). Aussi, plusieurs en vivo plaie cornéenne, modèles guérison ont été largement utilisés pour cicatrices études¹. Moins utilisé a été l’ex vivo cornée plaie guérison modèle^7,8 qui est décrit en détail ici. Cette méthode vise à quantifier les résultats cicatrisation caractérisées par les responsables fibreuses dans une 3D multicellulaires cornée ex vivo système de modèle.

Blessant épithéliale cornéenne qui ne viole pas la membrane basale épithéliale normalement ferme dans les 24 à 72 h⁹. Bientôt après la blessure, les cellules au bord de l’épithélium commencent à répandre et migrer vers la surface épithéliale et libre, pour rétablir la fonction barrière épithéliale. Cette activité est suivie dans l’ordre d’activation de la prolifération de la cornée Baso-cellulaire tout d’abord et, à un stade ultérieur, de cellules précurseurs situé dans la zone limbique extérieure pour obtenir la récupération de cellules épithéliales masse^10,11. Ces blessures guérissent souvent sans laisser de cicatrices. Cependant, une blessure qui pénètre la membrane de sous-sol dans le stroma souvent traduit par cicatrice formation¹. Après la blessure de stroma cornéen, le stroma est rempli avec des cellules de plusieurs origines, y compris les cellules stromales résidents différenciés ainsi que dérivés de la moelle osseuse des fibrocytes^12,13,14. Cicatrices fibreuses se caractérise par la persistance des myofibroblastes dans une plaie de guérison. Ces myofibroblastes pathologiques démontrent une adhérence accrue grâce à l’accumulation des intégrines en focales, fibres de stress contractile musculaire lisse α actine (α-SMA) et activation locale de la matrice extracellulaire (ECM)-séquestré latente-transformant le facteur de croissance-bêta (TGFβ). La différenciation des cellules épithéliales dérivées, sous le titre épithéliales transition mésenchymateuse (EMT), peut-être aussi contribuer à⁶de la formation de cicatrices.

Il y a un équilibre délicat entre la différenciation cellulaire et l’apoptose après la blessure. En raison de la violation dans les membranes basales, les facteurs de croissance comme facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF) et de TGFβ de larmes et de l’épithélium baignent le stroma, induisant la différenciation des myofibroblastes, une boucle autocrine soutenue d’activation de TGFβ, ainsi que la sécrétion de désorganisé fibrotique ECM^15,16. La persistance des myofibroblastes dans la blessure guérie favorise la brume et la cicatrisation de la cornée (Figure 2). Cependant, en régénération guéri plaie bien que développent des myofibroblastes, ils apoptose et donc sont absents ou significativement réduite en nombre dans les tissus cicatrisés (revu en référence^6,10). Ainsi, les recherches sur les cicatrices fibreuses portent au moins en partie sur le ciblage des molécules qui empêchent le développement excessif de myofibroblastes ou myofibroblastes persistance^17,18. Parce que la persistance de myofibroblastes caractérise les cicatrices et fibrose maladie dans tous les tissus¹⁹, la cornée peut être utile comme système modèle pour étudier les mécanismes cellulaires généraux de la fibrose.

Dans notre système de modèle, la cornée est blessée avec une lame cylindrique appelée un trépan tout en restant dans le monde entier. Humaine et cornées de porc peuvent être blessées avec soit un trépan mm 6 ou 7 ; pour les cornées de lapin un trépan de 6 mm est préférable. La cornée de cochon est similaire en taille à la cornée humaine. Parce qu’ils sont rentables et facilement disponibles en grand nombre, des cornées de porc sont couramment utilisées pour la culture de l’orgue. En outre, les anticorps et siRNAs fait réagir avec l’homme ont constamment réagissent avec porc⁷. Après la blessure, cornées sont découpées dans le monde entier avec le limbe intactes et monté sur une base de gélose/collagène. Les cornées sont cultivées dans un milieu sans sérum plusent stabilisé de vitamine C pour simuler la prolifération des fibroblastes et ECM dépôts²⁰. L’ajout de sérum ni facteurs de croissance sont nécessaires pour induire la formation de myofibroblastes⁷. Cornées sont systématiquement fixes et transformées pour histologie après deux semaines de culture. Pour de gène, ou pour tester les effets d’un agent sur la cicatrisation des plaies, la plaie peut être traitée avec des siARN dans la plaie après la blessure de⁷ ou un agent soluble peut être ajouté aux médias, respectivement⁸.

Protocol

1. organe Culture Préparations Préparer la solution d’agar comme suit. Dans un petit ballon, préparer 1 % d’agar et de collagène d’origine bovine en DMEM-F12 1 mg/mL à 20 mL. Porter à ébullition sur une plaque chauffante. Mettre la solution dans un tube conique de 50 mL. Placer le tube dans un bain d’eau sur une plaque chauffante pour empêcher la solution de solidification. Préparer supplémenté médias sans sérum (SSFM) selon la composition fournie dans…

Representative Results

Immunohistochemistry est le test principal utilisé pour analyser le succès de l’ex vivo plaie expérience de guérison. La figure 4 illustre l’épithélium et le stroma antérieur en tissu témoin (Figure 4 a, 4 b). Six heures après la blessure, l’épithélium est absente (Figure 4, 4D). Six jours après la blessure comme prévu, l’épithélium avait augme…

Discussion

Ce protocole décrit un modèle pour étudier la cicatrisation dans un environnement 3D stratifié naturel. Utilisation de la culture de l’orgue comme intermédiaire entre la culture cellulaire et études in vivo réduit considérablement les coûts ainsi que les procédures de réduction sur les animaux vivants. Autres modèles 3D ont été d’une grande utilité sur le terrain, y compris la synthèse des gels collagène fabriqués à partir de fibroblastes cornée humaine primaire² ou ces mê…

Materials

PBS	Gibco	10-010-023
Pen Strep	MP Biomedicals	91670049
Bovine Collagen Solution	Advance Biomatrix	5005
Pig eyes with lids attached	Pel-freeze, Arkansas	N/A
6.0 mm trephine	Katena	K28014
Surgical Blade	Personna	0.009
Small scissor	Fisher	895110
Forceps	Fisher	08953-F
Kim Wipes	Kimberly-Clark™ 34120	06-666
60 mm cell culture dishes	Falcon	08-772B
Supplemented Serum- Free media (SSFM)			Add all of the following components to DMEM/F-12:  ITS, RPMI, Glutathione, L-Glutamine, MEM Non essential amino acids, MEM Sodium Pyruvate, ABAM, Gentamicin, Vitamin C.
DMEM/F-12	Gibco	11330
ITS Liquid Media Supplement	Sigma	I3146	100X
RPMI 1640 Vitamins Solution	Sigma	R7256	100X
Glutathione	Sigma	G6013	Use at 1 µg/mL. Freeze aliquots; do not reuse after thawing.
1% L-glutamine solution	Gibco	25030-081	100X
MEM Non-essential amino acids solution	Gibco	11140	100X
MEM Sodium pyruvate solution	Gibco	11360	1 M Stocks (1000X) and freeze in single use aliquits.  Use from freezer each time media is made.
ABAM	Sigma	A7292	100X
Gentamicin	Sigma	30-005-CR	200X
Vitamin C	Wako	070-0483	2-0-aD Glucopyranosyl-Ascorbic Acid. 1 mM stocks (1000x)
10% Iodine	Fisher Chemical	SI86-1
Tissue Path Cassettes	Fisher	22-272416
Normal Goat Serum (NGS)	Jackson Immuno Research	005-000-121	We use 3% NGS
Mounting Media	Thermo Scientific	TA-030-FM
Safe Clear	Fisher	314-629
Ethyl Alcohol	Ultra Pure	200CSGP	200 Proof, diluted at 100%, 70%, 50%)
Sodium citrate	Fisher	BP327	10mM, pH 6.4
Hematoxylin	EMD Millipore	M10742500
Bluing agent	Ricca Chemical Company	220-106
1% Triton X-100	Fisher	9002-93-1	Diluted in PBS
0.1% Tween 20	Fisher	BP337	Diluted in PBS
3% Hydrogen Peroxide	Fisher	H324
DAB Kit	Vector Laboratories	SK-4100
Agar	Fisher	BP1423-500	Agar solution: prepare 1% agar and 1 mg/mL bovine collagen in DMEM-F12 up to 20 mL
Parafilm	Bermis	13-374-12
Moist Chamber			Use any chamber, cover it with wet Wipe Tissue and then put a layer of Parafilm over it.
Lipofectamine 2000
Qiagen RNAprotect Cell Reagent	Qiagen	76104
Ambion PureLink RNA Mini Kit	Thermo Scientific	12183018A
Anti-Fibronectin-EDA Antibody	Sigma	F6140	1:200 Diluted in  3% normal goat serum
Anti-alpha smooth muscle actin Antibody	Sigma	A2547 or C6198 (cy3 conjugated)	1:200 Diluted in 3% normal goat serum
Permafluor	Thermo Scientific	TA-030-FM
DAPI	Invitrogen	P36931
Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP	Invitrogen	62-6520	1:100 diluted in 3% normal goat serum (for a-SMA, DAB staining)
Gt anti -MS IgM (H+L) Secondary Antibody, HRP	Thermo Scientific	PA1-85999	1:100 diluted in 3% normal goat serum (for FN-EDA, DAB staining)
Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, Cy3	Jackson Immuno Research	115-165-146	1:200 Diluted in  3% normal goat serum (for a-SMA, Fluorescence staining)
Zeiss Axioplan2	Zeiss		Microscope
SPOT-2	Diagnostic Instruments, Sterling Heights, Michigan		CCD camera