Estructura cristalina del dominio N-terminal del Receptor de rianodina de Plutella xylostella
Summary
En este artículo se describen los protocolos de determinación de la expresión, purificación, cristalización y la estructura de la proteína del dominio N-terminal del receptor de rianodina de polilla del diamondback (xylostella de Plutella).
Abstract
Desarrollo de insecticidas potentes y eficientes dirigidos a receptores de insectos rianodina (RyRs) ha sido de gran interés en el área de control de plagas agrícolas. Hasta la fecha, varios de diamida de insecticidas contra plagas que ryrs han sido comercializados, que genera ingresos anuales de 2 billones de dólares. Pero la comprensión del modo de acción de insecticidas dirigidas a RyR es limitada por la falta de información estructural sobre insectos RyR. Esto a su vez restringe la comprensión del desarrollo de resistencia a los insecticidas en las plagas. La polilla del diamondback (DBM) es una plaga devastadora destruyendo cultivos crucíferos a nivel mundial, que también se ha reportado que muestran resistencia a los insecticidas de la diamida. Por lo tanto, es de gran importancia práctica para el desarrollo de nuevos insecticidas contra el RyR DBM, especialmente dirigidos a una región diferente del sitio de unión de la diamida tradicional. Aquí, presentamos un protocolo para caracterizar estructuralmente el dominio N-terminal de RyR de DBM. La estructura cristalina de la radiografía fue solucionada por reemplazo molecular con una resolución de 2.84 Å, que muestra un motivo plegamiento beta-trébol y una hélice alfa que flanqueaban. Este protocolo puede ser adaptado para la expresión, purificación y caracterización estructural de otros dominios o proteínas en general.
Introduction
Receptores de rianodina (RyRs) son canales iónicos específicos que median la penetración de iones de Ca2 + en las membranas del retículo sarcoplásmico (SR) en las células musculares. Por lo tanto, juegan un papel importante en la contracción excitación proceso de acoplamiento. En su forma funcional, la RyR monta como un homo-tetrámero con una masa molecular de > 2 MDa, con cada subunidad compuesta por residuos del aminoácido del ~ 5000. En los mamíferos, existen tres isoformas: RyR1 de tipo músculo esquelético, músculo cardiaco tipo de RyR2 – y RyR3-ubicuo se expresa en diferentes tejidos1.
En insectos hay un único tipo de RyR, que se expresa en el tejido muscular y nervioso2. RyR insectos es más similar a los RyR2 mamíferos con una identidad de secuencia de aproximadamente 47%3. Diamida insecticidas dirigidos a RyR de lepidópteros y coleópteros se han desarrollado y comercializado por grandes empresas como Bayer (flubendiamide), DuPont (chlorantraniliprole) y Syngenta (cyantraniliprole). Desde su reciente lanzamiento, diamida insecticidas se han convertido en uno de la clase de más rápido crecimiento de insecticidas. Actualmente, las ventas de estos tres insecticidas cada año han cruzado 2 billones de dólares con una tasa de crecimiento de más del 50% desde 2009 (Agranova).
Recientes estudios han reportado el desarrollo de resistencia en los insectos después de algunas generaciones de uso de estos insecticidas4,5,6,7,8. Las mutaciones de la resistencia en el dominio transmembrana de RyRs de la polilla del diamondback (DBM), Plutella xylostella (G4946E, I4790M) y las posiciones correspondientes de minador del tomate, Tuta absoluta (G4903E, I4746M) muestran que la región podría participar en el enlace de insecticida diamida como esta región es conocida por ser crítica para la compuerta del canal4,8,9. A pesar de extensas investigaciones en esta área, los mecanismos moleculares exactos de diamida insecticidas permanecen fuera de alcance. Por otra parte, no está claro si las mutaciones de resistencia afectan las interacciones con diamides directamente o allosterically.
Estudios anteriores han reportado la estructura de varios dominios de RyR de especies de mamíferos y la estructura de cuerpo entero RyR1 mamíferos y RyR2 por cristalografía de rayos x y microscopia del cryo-electrón, respectivamente10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Pero hasta el momento, ninguna estructura de insecto RyR se ha divulgado, que nos impide entender los entresijos moleculares de la función del receptor, así como los mecanismos moleculares de acción insecticida y el desarrollo de resistencia a los insecticidas.
En este manuscrito, presentamos un protocolo generalizado para la caracterización estructural de dominio β-trébol de N-terminal del receptor de rianodina de palomilla, una plaga destructiva que infectan cultivos crucíferas a nivel mundial22. La construcción fue diseñada según el conejo publicado RyR1 NTD cristal estructuras23,24y cryo-EM modelos estructurales16,17,18,19, 20 , 21. esta es la primera estructura de alta resolución para insectos RyR, que revela el mecanismo de compuerta canal y proporciona una plantilla importante para el desarrollo de insecticidas específicos usando el diseño de fármacos basado en estructura. Para la aclaración de la estructura, se empleó Cristalografía de rayos x, que se considera como el gold standard para la determinación de la estructura de proteínas en cerca de resolución atómica. Aunque el proceso de cristalización es impredecible y mano de obra, este protocolo paso a paso le ayudará a los investigadores a expresar, purificar y caracterizar otros dominios de insecto RyR o cualquier otras proteínas en general.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este papel, describimos el procedimiento para expresar por vía recombinante, purificar, cristalizar y determinar la estructura de DBM RyR NTD. Para la cristalización, un requisito crucial es obtener proteínas con homogeneidad, pureza y alta solubilidad. En nuestro protocolo, decidimos utilizar vector pET-28a-HMT ya que contiene un hexahistidine etiqueta y etiqueta de la MBP, que pueden ser utilizados para que la purificación obtener una mayor pureza de doblez. Además, el MBP etiqueta SIDA en la solubilidad de la …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La financiación para esta investigación fue proporcionada por: nacionales de investigación clave y programa de desarrollo de China (2017YFD0201400, 2017YFD0201403), nacional naturaleza ciencia Fundación de China (31320103922, 31230061) y proyecto de nacional investigación básica (973) programa de China (2015CB856500, 2015CB856504). Estamos muy agradecidos al personal en la línea BL17U1 en instalaciones de Radiación Sincrotrón Shanghai (SSRF).
Materials
| pET-28a-HMT vector | This modified pET vector contains a hexahistidine tag, an MBP fusion protein and a TEV protease cleavage site at the N-terminus (Lobo and Van Petegem, 2009) | ||
| E. coli BL21 (DE3) strain | Novagen | 69450-3CN | |
| HisTrapHP column (5 mL) | GE Healthcare | 45-000-325 | |
| Amylose resin column | New England Biolabs | E8021S | |
| Q Sepharose high-performance column | GE Healthcare | 17-1154-01 | |
| Amicon concentrators (10 kDa MWCO) | Millipore | UFC901008 | |
| Superdex 200 26/600 gel-filtration column | GE Healthcare | 28-9893-36 | |
| Automated liquid handling robotic system | Art Robbins Instruments | Gryphon | |
| 96 Well CrystalQuick | Greiner bio-one | 82050-494 | |
| Uni-Puck | Molecular Dimensions | MD7-601 | |
| Mounted CryoLoop – 20 micron | Hampton Research | HR4-955 | |
| CryoWand | Molecular Dimensions | MD7-411 | |
| Puck dewar loading tool | Molecular Dimensions | MD7-607 | |
| Nano drop | Thermo Scientific | NanoDrop One | |
| Crystal incubator | Molecular Dimensions | MD5-605 | |
| X-Ray diffractor | Rigaku | FRX | |
| PCR machine | Eppendorf | Nexus GX2 | |
| Plasmid mini-prep kit | Qiagen | 27104 | |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| SspI restriction endonuclease | NEB | R0132S | |
| T4 DNA polymerase | Novagen | 2868713 | |
| Kanamycin | Scientific Chemical | 25389940 | |
| IPTG | Genview | 367931 | |
| HEPES | Genview | 7365459 | |
| β-mercaptoethanol | Genview | 60242 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall LYNX 6000 | |
| Sonnicator | Scientz | II-D | |
| Protein purification system | GE Healthcare | Akta Pure | |
| Light microscope | Nikon | SMZ745 | |
| IzIt crystal dye | Hampton Research | HR4-710 | |
| Electrophoresis unit | Bio-Rad | 1658005EDU | |
| Shaker Incubator | Zhicheng | ZWYR-D2401 | |
| Index crystal screen | Hampton Research | HR2-144 | |
| Structure crystal screen | Molecular Dimensions | MD1-01 | |
| ProPlex crystal screen | Molecular Dimensions | MD1-38 | |
| PACT premier crystal screen | Molecular Dimensions | MD1-29 | |
| JCSG-plus crystal screen | Molecular Dimensions | MD1-37 |
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