Photoblanchiment permet l’imagerie de l’anneau FtsZ dans la cyanobactérie Prochlorococcus Super-résolution
Summary
Nous décrivons ici une méthode de photoblanchiment afin de réduire l’autofluorescence des cyanobactéries. Après photoblanchiment, microscopie stochastique reconstruction optique est utilisée pour obtenir des images de Super-résolution en trois dimensions de l’anneau FtsZ cyanobactérie.
Abstract
Microscopie de Super-résolution a été largement utilisée pour étudier les interactions entre protéines et structures subcellulaires chez de nombreux organismes. Des organismes photosynthétiques, cependant, la résolution latérale de l’imagerie de Super-résolution est seulement ~ 100 nm. La faible résolution résulte principalement de l’arrière-plan de l’autofluorescence élevé des cellules photosynthétiques causée par des lasers de haute intensité qui sont nécessaires pour l’imagerie Super-résolution, telles que la microscopie stochastique reconstruction optique (tempête). Nous décrivons ici une méthode assistée par photoblanchiment STORM a été mis au point récemment pour l’imagerie de la marine picocyanobacterium Prochlorococcus. Après photoblanchiment, l’autofluorescence de Prochlorococcus est effectivement réduit donc cette tempête peut être effectuée avec une résolution latérale d’environ 10 nm. En utilisant cette méthode, nous acquérir l’organisation in vivo en trois dimensions (3d) de la protéine FtsZ et caractériser les quatre différentes morphologies de bague FtsZ durant le cycle cellulaire de Prochlorococcus. La méthode que nous décrivons ici pourrait être adoptée pour l’imagerie de Super-résolution d’autres organismes photosynthétiques.
Introduction
Microscopies Super-résolution peuvent briser la limite de diffraction de la lumière et fournir des images dans les résolutions de diffraction sous (< 200 nm). Ils ont été largement utilisés dans de nombreux organismes pour étudier la localisation des protéines et des structures subcellulaires. Major Super-résolution méthodes de microscopie comprennent illumination structurée microscopie (SIM), stimulée par la microscopie d’appauvrissement de la couche d’émission (STED), STORM et microscopie de localisation de photoactivation (PALM). Les mécanismes et les applications de ces super-résolution microscopes ont été examinés ailleurs1,2.
ORAGE peut aboutir à une résolution aussi élevée que 10 nm par séparation spatiale3,4. Pour STORM, qu’une seule molécule dans une région limitée par la diffraction est activée (« on ») et le reste des molécules restent inactivés (« off »). Par une accumulation de marche rapide et – à côté de molécules simples, une image « diffraction-illimité » peut être généré3. Pendant ce temps, plusieurs sortes de colorants organiques et des protéines fluorescentes sont applicables dans la tempête, ce qui permet une mise à niveau facile de microscopie de fluorescence ordinaire à la microscopie à haute résolution5,6.
TEMPÊTE n’a pas été largement appliquée dans les cellules photosynthétiques, comme les cyanobactéries, algues, et les cellules végétales avec chloroplastes7,8, qui est dû au fait que tempête exige intensité laser haute de disque photoswitching. Le laser de haute intensité défavorablement excite fort autofluorescence fond dans les cellules photosynthétiques et interfère avec la localisation de la molécule unique en imagerie de la tempête. Afin d’utiliser tempête pour étudier les structures subcellulaires ou les interactions de protéine dans les cellules photosynthétiques, nous avons élaboré un protocole de photoblanchiment pour étancher l’arrière-plan autofluorescence signaux9. Dans une méthode systématique de la coloration par immunofluorescence, spécimens sont exposés à la lumière blanche de forte intensité pendant l’étape de blocage, qui abaisse l’autofluorescence des cellules photosynthétiques pour répondre aux exigences de la tempête. Par conséquent, ce protocole rend possible d’enquêter sur les organismes pigmentés avec STORM.
Nous décrivons ici le protocole pour utiliser tempête à l’image de l’organisation de bague FtsZ dans le picocyanobacterium unicellulaire Prochlorococcus. FtsZ est une protéine du cytosquelette de tubuline-comme hautement conservée qui se polymérise pour former une structure d’anneau (l’anneau Z) autour de la circonférence d’une cellule10 et est essentielle pour la division cellulaire11. Prochlorococcus cellules sont photobleached première pour réduire l’arrière-plan auto-fluorescente et immunomarquage avec un anticorps anti-FtsZ primaire et ensuite, un anticorps secondaire au anti-lapin IgG (H + L) se sont réuni avec un fluorophore (par exemple , Alexa Fluor 750). Finalement, STORM est utilisé pour observer les organisations d’anneau FtsZ détaillées dans Prochlorococcus pendant les étapes du cycle de cellules différentes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce protocole, nous avons décrit une procédure pour réduire de façon significative l’autofluorescence de la cyanobactérie Prochlorococcus (Figure 3) et, ensuite, réagissent les protéines dans les cellules, ce qui nous a permis d’utiliser la tempête afin d’étudier la FtsZ 3D morphologies anneau en Prochlorococcus (Figure 4). Ce protocole pourrait être adopté pour l’imagerie de Super-résolution chez d’autres organismes p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Daiying Xu pour son assistance technique et les commentaires sur le manuscrit. Cette étude est financée par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (numéro du projet 41476147) et le Conseil de subventions de recherche de la région Administrative spéciale de Hong Kong, Chine (numéros de projet 689813 et 16103414).
Materials
| Polystyrene particles | Spherotech | PP-20-10 | 2.0-2.4 µm |
| Coverslip | Marienfeld | 0111580 | 18 mm ∅, Thickness No. 1 |
| Ethanol | Scharlau | ET00021000 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P9155 | mol wt 70,000-150,000 |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Glutaraldehyde solution, 50% | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| PBS | Sigma | P3813 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| EDTA Disodium Salt, 2-hydrate | Gold biotechnology | E-210-500 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| anti-Anabaena FtsZ antibody | Agrisera | AS07217 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Life Technologies | A-21039 | conjugated with Alexa Fluor 750 |
| D-Glucose Anhydrous | Fisher Scientific | D16-1 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Methyl Viologen | Sigma-Aldrich | 856177 | |
| Cyclooctatetraene | Sigma-Aldrich | 138924 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | 646547 | |
| Glucose Oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| XD-300 Xenon light source | 250 W | ||
| STORM microscope | NBI | SRiS microscope | |
| Rohdea | NBI | SRiS 3.0 | software for imaging acquisition |
| Luna | NBI | SRiS 3.0 | software for drifting correction |
| QuickPALM | https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis | ||
| 3D Viewer | http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&category=Home |
References
- Huang, B., Babcock, H., Zhuang, X. Breaking the diffraction barrier: Super-resolution imaging of cells. Cell. 143 (7), 1047-1058 (2010).
- Toomre, D., Bewersdorf, J. A New Wave of Cellular Imaging. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 285-314 (2010).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods Methods. 8 (12), 1027-1036 (2012).
- Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Komis, G., Šamajová, O., Ovečka, M., Šamaj, J. Super-resolution Microscopy in Plant Cell Imaging. Trends in Plant Science. 20 (12), 834-843 (2015).
- Schubert, V. Super-resolution Microscopy – Applications in Plant Cell Research. Frontiers in Plant Science. 8, 531 (2017).
- Liu, R., et al. Three-Dimensional Superresolution Imaging of the FtsZ Ring during Cell Division of the Cyanobacterium Prochlorococcus. mbio. 8 (6), e00657 (2017).
- Adams, D. W., Errington, J. Bacterial cell division: assembly, maintenance and disassembly of the Z ring. Nature Reviews Microbiology. 7, 642-653 (2009).
- Boer, P. A. Advances in understanding E. coli cell fission. Current Opinion in Microbiology. 13 (6), 730-737 (2010).
- Moore, L. R., Post, A. F., Rocap, G., Chisholm, S. W. Utilization of different nitrogen sources by the marine cyanobacteria Prochlorococcus and Synechococcus. Limnology and Oceanography. 47 (4), 989-996 (2002).
- Zhao, T., et al. A user-friendly two-color super-resolution localization microscope. Optics Express. 23 (2), 1879 (2015).
- Henriques, R., Lelek, M., Fornasiero, E. F., Valtorta, F., Zimmer, C., Mhlanga, M. M. QuickPALM: 3D real-time photoactivation nanoscopy image processing in ImageJ. Nature Methods. 7 (5), 339-340 (2010).
- Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ. BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).
- Ting, C. S., Rocap, G., King, J., Chisholm, S. W. Cyanobacterial photosynthesis in the oceans: The origins and significance of divergent light-harvesting strategies. Trends in Microbiology. 10 (3), 134-142 (2002).
- Biller, S. J., Berube, P. M., Lindell, D., Chisholm, S. W. Prochlorococcus: The structure and function of collective diversity. Nature Reviews Microbiology. 13 (1), 13-27 (2015).
- Morel, A., Ahn, Y. -. H., Partensky, F., Vaulot, D., Claustre, H. Prochlorococcus and Synechococcus – a Comparative-Study of Their Optical-Properties in Relation To Their Size and Pigmentation. Journal of Marine Research. 51, 617-649 (1993).
- Holden, S. J., Pengo, T., Meibom, K. L., Fernandez, C., Collier, J., Manley, S. High throughput 3D super-resolution microscopy reveals Caulobacter crescentusin vivo Z-ring organization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (12), 4566-4571 (2014).
- Zhao, M., Wei, B., Chiu, D. T. Imaging multiple biomarkers in captured rare cells by sequential immunostaining and photobleaching. Methods. 64 (2), 108-113 (2013).
- Golcuk, K., Mandair, G. S., Callender, A. F., Sahar, N., Kohn, D. H., Morris, M. D. Is photobleaching necessary for Raman imaging of bone tissue using a green laser?. Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (7), 868-873 (2006).
- Haxo, F. T., Blinks, L. R. Photosynthetic Action Spectra of Marine Algae. The Journal of General Physiology. 33 (4), 389-422 (1950).
- Bryant, D. A. Phycoerythrocyanin and Phycoerythrin: Properties and Occurrence in Cyanobacteria. Journal of General Microbiology. 128 (4), 835-844 (1982).
