Photobleaching은 Cyanobacterium Prochlorococcus 에서 FtsZ 반지의 슈퍼 해상도 이미징 가능

요약

여기 우리는 박테리아의 autofluorescence를 줄이기 위해 photobleaching 메서드를 설명 합니다. Photobleaching, 후 확률적 광학 재건 현미경 cyanobacterial FtsZ 반지의 3 차원 슈퍼 해상도 이미지를 얻을 하는 데 사용 됩니다.

초록

슈퍼 해상도 현미경은 단백질 상호 작용 및 많은 유기 체에서 subcellular 구조 연구에 널리 사용 되었습니다. 그러나 광합성 유기 체,, 슈퍼 해상도 영상의 가로 해상도만 ~ 100 nm. 낮은 해상도 확률적 광학 재건 현미경 (폭풍) 등 슈퍼 해상도 영상에 필요한 고 강도 레이저에 의해 발생 하는 광합성 세포의 높은 autofluorescence 배경 때문 이다. 여기, 우리는 photobleaching 기반 폭풍 방법을 개발 된 최근 해양 picocyanobacterium Prochlorococcus이미징 기술. Photobleaching, 후 Prochlorococcus 의 autofluorescence는 효과적으로 감소 그 폭풍 ~ 10의 측면 분해능으로 수행할 수 있도록 nm. 이 방법을 사용 하 여, 우리는 FtsZ 단백질의 조직에 vivo에서 3 차원 (3 차원)을 취득 하 고 Prochlorococcus의 세포 주기 동안 4 개의 다른 FtsZ 반지 형태학 특성. 우리는 여기에 설명 하는 방법 다른 광합성 유기 체의 슈퍼 해상도 이미징에 대 한 채택 될 수도 있습니다.

서론

슈퍼 해상도 microscopies 빛의 회절 한계를 휴식 하 고 하위 회절 해상도 (< 200 nm) 내에서 이미지를 제공할 수 있습니다. 그들은 널리 사용 되었습니다 많은 유기 체에서 단백질 지 방화 및 subcellular 구조 공부 하. 슈퍼 해상도 현미경 방법 등 구조화 조명 현미경 (SIM)를 주요 자극 방출 소모 현미경 (호텔 위치), 폭풍, 그리고 photoactivated 지역화 현미경 검사 법 (종 려). 메커니즘 및 응용 프로그램의 이러한 슈퍼 해상도 현미경 되었습니다 다른^1,2검토.

폭풍 10 높은 해상도 달성할 수 있다 공간 분리^3,4nm. 폭풍, 회절 제한 된 지역 내에서 하나의 분자 ("에") 활성화 되 고 분자의 나머지 ("off") 사 유지 됩니다. 단일 분자의-와 급속 한 스위치에의 축적, "회절 무제한" 이미지 생성된³수 있습니다. 한편, 많은 종류의 유기 염료 및 형광 단백질 고해상도 현미경^5,<....

프로토콜

1. 샘플 준비 및 고정

1. 해 수 기반 Pro99 중간¹²의 5 mL을 axenic Prochlorococcus MED4의 1 mL 접종 5 일 후 35 µmol 광자/m²s의 진도 빛 아래 23 ° C에서 Prochlorococcus 문화 성장, 1.5 mL 튜브에 문화의 1 mL를 수집 합니다.
   참고:는 접종 후 5 일 Prochlorococcus MED4 도달 한다 늦은 로그 단계, 약 10⁸ 셀/mL, 폭풍 이미징에 대 한 적절 한입니다.
2. 문화를 해결 하기 위해 1.5 mL 튜브에 갓 25 %paraformaldehyde (PFA) (w/v)에서 준비 하는 포름알데히드의 100 µ L, 50% 글의 2 µ L를 추가 합니다. 20 분 동안 실내 온도에 어둠 속에서 샘플을 품 어.
   참고: 샘플은 유지 고정을 위한 어둠 속에도 빛 때문에 민감한.
3. 스핀 1 분; 13500 x g 에서 샘플 다운 그리고는 상쾌한 제거 resuspend Pro99 중간¹²의 100 µ L에 셀. Immunostaining까지 4 ° C에서 샘플을 저장 합니다.<....

결과

폭풍 확률론 개별 photoswitchable fluorophores를 활성화 하 여 슈퍼 해상도 이미지를 달성 한다. 각 fluorophore의 위치를 기록 하 고 슈퍼 해상도 이미지 다음이 위치⁴에 따라 만들어집니다. 따라서, fluorophore 위치 정밀도 슈퍼 해상도 이미지 재건을 위해 중요 하다. 447 Prochlorococcus 의 흡수 스펙트럼 피크 및 680 nm,그리고 Prochlorococcus는 최소 흡수 700 nm¹⁶위 파장에. 그러나, Prochlorococcus MED4 세포는 여전히 높은 autofluorescence 750 nm 레이저 (그림 3A), 폭풍 영상 필요의 매우 높은 농도에 노출 될 경우 발생 합니다. 따라서, 높은 autofluoresce.......

토론

이 프로토콜에서 설명 하는 cyanobacterium Prochlorococcus (그림 3C)의 autofluorescence를 크게 감소 하는 절차와, 다음, immunostain 공부 3 차원 FtsZ 폭풍을 활용 수 있게 세포에 있는 단백질 반지 Prochlorococcus (그림 4)에서 형태학. 이 프로토콜은 슈퍼 해상도 영상 다른 광합성 유기 체에 대 한 채택 될 수도 있습니다.

광합성 유기 체에 대 한 이전 연구 주로 슈퍼 해상도 이미징 SIM 높은 강도 레이저를 필요로 하지 않습니다 달성 하기 위해 SIM을 사용. 그러나, SIM의 공간 해상도가입니다만 ~ 100 nm¹, 폭풍의 그것 보다 훨씬 낮은. 이 연구에서는 폭풍 이미지의 공간 해상도 9.6 도달할 수 z 축

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
폴리스티렌 입자	Spherotech	PP-20-10	2.0-2.4 µ m
커버슬립	Marienfeld	0111580	18mm ∅, 두께 번호 1
에탄올	Scharlau	ET00021000
폴리-L-라이신 하이드로브로마이드	시그마-알드리치	P9155	mol wt 70,000-150,000
파라포름알데히드	시그마-알드리치	158127
글루타르알데히드 용액, 50%	시그마-알드리치	340855
PBS	Sigma	P3813
Triton X-100	Sigma	T8787
EDTA Disodium Salt, 2-hydrate	Gold 생명공학	E-210-500
Trizma base	Sigma	T1503
Lysozyme	Sigma	L6876
염소 혈청	Sigma	G9023
항<> Anabaena FtsZ 항체	Agrisera	AS07217
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) 교차 흡착 2차 항체	Life Technologies	A-21039	Alexa Fluor 750
D-Glucose 무수	Fisher Scientific	D16-1
L-아스코르브산	Sigma-Aldrich	A5960
메틸 바이올로겐	Sigma-Aldrich
시클로옥타테트라엔	시그마-알드리치	138924
트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)	시그마-알드리치	646547
포도당 산화효소	시그마-알드리치	G2133
카탈라아	제 시그마-알드리치	C9322
XD-300 제논 광원			250W
STORM 현미경	NBI	SRiS 현미경
Rohdea	NBI	SRiS 3.0	이미징 획득용 소프트웨어
, Luna	NBI	SRiS 3.0	드리프트 보정용 소프트웨어
QuickPALM			https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis
3D 뷰어			http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&category=Home

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