Photobleaching aktiverer super-oppløsning Imaging FtsZ ringen i Cyanobacterium Prochlorococcus
Summary
Her beskriver vi en photobleaching metode for å redusere autofluorescence av Cyanobakterie. Etter photobleaching brukes stokastiske optisk rekonstruksjon mikroskopi til å få tredimensjonal super-oppløsning bilder av cyanobacterial FtsZ ringen.
Abstract
Super-oppløsning mikroskopi er mye brukt til å studere protein interaksjoner og subcellular strukturer i mange organismer. I fotosynteseaktiviteten organismer, men lateral oppløsningen på super-oppløsning imaging er bare ~ 100 nm. Den lave oppløsningen skyldes i hovedsak høye autofluorescence bakgrunnen fotosynteseaktiviteten celler forårsaket av høy intensitet lasere som kreves for super-oppløsning bildebehandling, som Stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi (STORM). Her beskriver vi en photobleaching-assistert STORM metode som ble utviklet nylig for imaging marine picocyanobacterium Prochlorococcus. Etter photobleaching, autofluorescence av Prochlorococcus effektivt reduseres slik at STORM kan utføres med en lateral oppløsning på ~ 10 nm. Bruker denne metoden, vi skaffe i vivo tredimensjonale (3D) organiseringen av FtsZ protein og karakterisere fire ulike FtsZ ring morphologies under cellen syklus av Prochlorococcus. Metoden som beskrives her kan vedtas for super-oppløsning avbilding av andre fotosynteseaktiviteten organismer.
Introduction
Super-oppløsning microscopies kan bryte Diffraksjon grensen av lys og gir bilder i sub Diffraksjon oppløsninger (< 200 nm). De har vært mye brukt i mange organismer protein lokalisering og subcellular strukturer. Store super-oppløsning mikroskopi metodene omfatter strukturert belysning mikroskopi (SIM), stimulert utslipp uttømming mikroskopi (STED), STORM og photoactivated lokalisering mikroskopi (PALM). Mekanismer og bruk av disse super-oppløsning mikroskop har vært vurdert andre steder1,2.
STORMEN kan oppnå så høy som 10 oppløsning nm av romlige separasjon3,4. For STORM, bare ett molekyl innenfor et Diffraksjon-begrenset område er aktivert (“på”) og resten av molekyler blir holdt deaktivert (“off”). En opphopning av rask slå på- og – ut av enkelt molekyler, kan en “Diffraksjon-ubegrenset” bilde være generert3. I mellomtiden, mange typer organisk fargestoffer og fluorescerende proteiner gjelder i STORM, slik at en enkel oppgradering fra vanlige fluorescens mikroskopi til høy oppløsning mikroskopi5,6.
STORMEN har ikke vært mye brukt i fotosynteseaktiviteten celler, for eksempel Cyanobakterie, alger, og anlegget celler med chloroplasts7,8, som skyldes faktum at STORM krever høy laser intensitet for å kjøre photoswitching. Høy intensitet laser unfavorably interesserer sterk autofluorescence bakgrunn i fotosynteseaktiviteten celler og forstyrrer den single-molekyl lokaliseringen i STORM bildebehandling. Bruke STORM for å undersøke subcellular strukturer eller protein interaksjoner i fotosynteseaktiviteten celler, utviklet vi en photobleaching protokoll for å slukke bakgrunn autofluorescence signaler9. I en rutinemessig immunofluorescent flekker prosedyre, er prøver utsatt for hvitt lys med en høy intensitet under det blokkerende trinnet, som senker autofluorescence fotosynteseaktiviteten celler som oppfyller kravene for STORM. Dermed gjør denne protokollen det mulig å undersøke pigmentert organismer med STORM.
Her beskriver vi protokollen for å bruke STORM for å image FtsZ ring organisasjonen i den encellede picocyanobacterium Prochlorococcus. FtsZ er en høyt konservert tubulin-lignende cellen cytoskjelett proteiner som polymerizes for å danne en ring struktur (Z ringen) rundt omkretsen av en celle10 og er avgjørende for celledeling11. Bevart Prochlorococcus cellene er første photobleached å redusere autofluorescent bakgrunnen og immunostained med et primære anti-FtsZ antistoff, og deretter en sekundær anti-kanin IgG (H + L) antistoffer blir bøyd med en fluorophore (f.eks , Alexa Fluor 750). Til slutt, brukes STORM til å observere de detaljerte FtsZ ring organisasjonene i Prochlorococcus under forskjellige cellen syklus faser.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne protokollen, vi beskrev en prosedyre for å redusere autofluorescence av cyanobacterium Prochlorococcus (Figur 3 c) og deretter immunostai proteinene i celler som mulig for oss å bruke STORM å studere det 3D FtsZ Ring morphologies i Prochlorococcus (Figur 4). Denne protokollen kan vedtas for super-oppløsning imaging i andre fotosynteseaktiviteten organismer.
Tidligere studier på fotosynteseaktiviteten org…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Daiying Xu for hennes kundestøtte og kommentarer på manuskriptet. Denne studien er støttet av tilskudd fra National Natural Science Foundation av Kina (prosjektnummeret 41476147) og gir forskningsråd Hong Kong spesiell administrativ Region, Kina (prosjektnumre 689813 og 16103414).
Materials
| Polystyrene particles | Spherotech | PP-20-10 | 2.0-2.4 µm |
| Coverslip | Marienfeld | 0111580 | 18 mm ∅, Thickness No. 1 |
| Ethanol | Scharlau | ET00021000 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P9155 | mol wt 70,000-150,000 |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Glutaraldehyde solution, 50% | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| PBS | Sigma | P3813 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| EDTA Disodium Salt, 2-hydrate | Gold biotechnology | E-210-500 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| anti-Anabaena FtsZ antibody | Agrisera | AS07217 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Life Technologies | A-21039 | conjugated with Alexa Fluor 750 |
| D-Glucose Anhydrous | Fisher Scientific | D16-1 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Methyl Viologen | Sigma-Aldrich | 856177 | |
| Cyclooctatetraene | Sigma-Aldrich | 138924 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | 646547 | |
| Glucose Oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| XD-300 Xenon light source | 250 W | ||
| STORM microscope | NBI | SRiS microscope | |
| Rohdea | NBI | SRiS 3.0 | software for imaging acquisition |
| Luna | NBI | SRiS 3.0 | software for drifting correction |
| QuickPALM | https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis | ||
| 3D Viewer | http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&category=Home |
References
- Huang, B., Babcock, H., Zhuang, X. Breaking the diffraction barrier: Super-resolution imaging of cells. Cell. 143 (7), 1047-1058 (2010).
- Toomre, D., Bewersdorf, J. A New Wave of Cellular Imaging. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 285-314 (2010).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods Methods. 8 (12), 1027-1036 (2012).
- Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Komis, G., Šamajová, O., Ovečka, M., Šamaj, J. Super-resolution Microscopy in Plant Cell Imaging. Trends in Plant Science. 20 (12), 834-843 (2015).
- Schubert, V. Super-resolution Microscopy – Applications in Plant Cell Research. Frontiers in Plant Science. 8, 531 (2017).
- Liu, R., et al. Three-Dimensional Superresolution Imaging of the FtsZ Ring during Cell Division of the Cyanobacterium Prochlorococcus. mbio. 8 (6), e00657 (2017).
- Adams, D. W., Errington, J. Bacterial cell division: assembly, maintenance and disassembly of the Z ring. Nature Reviews Microbiology. 7, 642-653 (2009).
- Boer, P. A. Advances in understanding E. coli cell fission. Current Opinion in Microbiology. 13 (6), 730-737 (2010).
- Moore, L. R., Post, A. F., Rocap, G., Chisholm, S. W. Utilization of different nitrogen sources by the marine cyanobacteria Prochlorococcus and Synechococcus. Limnology and Oceanography. 47 (4), 989-996 (2002).
- Zhao, T., et al. A user-friendly two-color super-resolution localization microscope. Optics Express. 23 (2), 1879 (2015).
- Henriques, R., Lelek, M., Fornasiero, E. F., Valtorta, F., Zimmer, C., Mhlanga, M. M. QuickPALM: 3D real-time photoactivation nanoscopy image processing in ImageJ. Nature Methods. 7 (5), 339-340 (2010).
- Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ. BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).
- Ting, C. S., Rocap, G., King, J., Chisholm, S. W. Cyanobacterial photosynthesis in the oceans: The origins and significance of divergent light-harvesting strategies. Trends in Microbiology. 10 (3), 134-142 (2002).
- Biller, S. J., Berube, P. M., Lindell, D., Chisholm, S. W. Prochlorococcus: The structure and function of collective diversity. Nature Reviews Microbiology. 13 (1), 13-27 (2015).
- Morel, A., Ahn, Y. -. H., Partensky, F., Vaulot, D., Claustre, H. Prochlorococcus and Synechococcus – a Comparative-Study of Their Optical-Properties in Relation To Their Size and Pigmentation. Journal of Marine Research. 51, 617-649 (1993).
- Holden, S. J., Pengo, T., Meibom, K. L., Fernandez, C., Collier, J., Manley, S. High throughput 3D super-resolution microscopy reveals Caulobacter crescentusin vivo Z-ring organization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (12), 4566-4571 (2014).
- Zhao, M., Wei, B., Chiu, D. T. Imaging multiple biomarkers in captured rare cells by sequential immunostaining and photobleaching. Methods. 64 (2), 108-113 (2013).
- Golcuk, K., Mandair, G. S., Callender, A. F., Sahar, N., Kohn, D. H., Morris, M. D. Is photobleaching necessary for Raman imaging of bone tissue using a green laser?. Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (7), 868-873 (2006).
- Haxo, F. T., Blinks, L. R. Photosynthetic Action Spectra of Marine Algae. The Journal of General Physiology. 33 (4), 389-422 (1950).
- Bryant, D. A. Phycoerythrocyanin and Phycoerythrin: Properties and Occurrence in Cyanobacteria. Journal of General Microbiology. 128 (4), 835-844 (1982).
