Photobleaching giver mulighed for super-opløsning billeddannelse af FtsZ Ring i Cyanobacterium Prochlorococcus
Summary
Her beskriver vi en photobleaching metode til at reducere autofluorescence af cyanobakterier. Efter photobleaching anvendes stokastiske optisk genopbygning mikroskopi til at opnå tre-dimensionelle super-opløsning billeder af cyanobakteriel FtsZ ring.
Abstract
Super-resolution mikroskopi har været meget anvendt til at undersøge protein interaktioner og subcellulært strukturer i mange organismer. I fotosyntetiske organismer, men den laterale opløsning på Super-resolution imaging er kun ~ 100 nm. Lav-opløsning er hovedsagelig på grund af den høje autofluorescence baggrund af fotosyntetiserende celler forårsaget af høj intensitet lasere, der er nødvendige for super-opløsning imaging, såsom stokastiske optisk genopbygning mikroskopi (STORM). Her, beskriver vi en photobleaching-assisteret STORM metode som blev udviklet for nylig til imaging den marine picocyanobacterium Prochlorococcus. Efter photobleaching, autofluorescence af Prochlorococcus reduceres effektivt, så denne STORM kan udføres med en lateral opløsning på ~ 10 nm. Brug denne metode, vi erhverve i vivo tre-dimensionel (3-D)-organisation af FtsZ proteinet og karakterisere fire forskellige FtsZ ring morfologier under celle cyklus af Prochlorococcus. Metoden vi beskrive her kan vedtages for super-opløsning billeddannelse af andre fotosyntetiske organismer.
Introduction
Super-opløsning microscopies kan bryde diffraktion grænse lysets og give billeder inden for sub diffraktion resolutioner (< 200 nm). De har været meget udbredt i mange organismer til at studere proteiner lokalisering og subcellulært strukturer. Major super-resolution mikroskopi metoder omfatter strukturerede belysning mikroskopi (SIM), stimuleret emission udtynding mikroskopi (STED), STORM og photoactivated lokalisering mikroskopi (PALM). De mekanismer og anvendelser af disse super-opløsning mikroskoper har været gennemgået andetsteds1,2.
STORM kan opnå en opløsning så høj som 10 nm af rumlig adskillelse3,4. For STORM, kun ét molekyle i en diffraktion-begrænset region er aktiveret (“om”) og resten af molekylerne holdes inaktiverede (“off”). Af en ophobning af hurtig tænd og – ud af enkelt molekyler, kan en “diffraktion-ubegrænset” billede være genereret3. I mellemtiden, mange slags organiske farvestoffer og fluorescerende proteiner er gældende i STORM, giver mulighed for en nem opgradering fra regelmæssige Fluorescens mikroskopi til høj opløsning mikroskopi5,6.
STORM har ikke er almindeligt anvendt i fotosyntetiserende celler, såsom cyanobakterier, alger, og planteceller med grønkorn7,8, som skyldes, at STORM kræver høj laser intensitet til at drive photoswitching. Høj intensitet laser ugunstig ophidser stærk autofluorescence baggrund i fotosyntetiserende celler og forstyrrer den enkelt-molekyle lokalisering i STORM billedbehandling. For at bruge STORM til at undersøge subcellulært strukturer eller protein interaktioner i fotosyntetiserende celler, udviklede vi en photobleaching protokol for at slukke baggrund autofluorescence signaler9. I en rutinemæssig immunfluorescent farvning procedure udsættes prøver for hvidt lys med en høj intensitet under trinnet blokering, der sænker autofluorescence af fotosyntetiserende celler til at opfylde kravene til STORM. Således, denne protokol gør det muligt at undersøge pigmenteret organismer med STORM.
Her beskriver vi protokol for at bruge STORM for at billede FtsZ ring organisation i den encellede picocyanobacterium Prochlorococcus. FtsZ er en stærkt bevarede tubulin-lignende cytoskeletal proteiner, der polymeriserer for at danne en ring struktur (Z-ring) omkring omkredsen af en celle10 og er vigtig for celledeling11. Bevaret Prochlorococcus celler er første photobleached til reduktion af autofluorescent baggrund og immunostained med en primær anti-FtsZ antistof, og derefter en sekundær anti-kanin IgG (H + L) antistof konjugeret med et fluorophore (f.eks. , Alexa Fluor 750). Til sidst, bruges STORM til at observere de detaljerede FtsZ ring organisationer i Prochlorococcus under forskellige cellecyklus faser.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne protokol, vi beskrev en procedure for at reducere autofluorescence af cyanobacterium Prochlorococcus (figur 3 c) og derefter, immunostain proteiner i cellerne, som gjorde det muligt for os at udnytte STORM til at studere den 3D-FtsZ ring morfologier i Prochlorococcus (figur 4). Denne protokol kan vedtages for super-opløsning imaging i andre fotosyntetiske organismer.
Tidligere undersøgelser på fotosyntetis…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takke Daiying Xu for hendes teknisk bistand og kommentarer til manuskriptet. Denne undersøgelse er støttet af tilskud fra den National Natural Science Foundation of China (projektnummer 41476147) og forskningsråd i tilskud af Hong Kong Special Administrative Region, Kina (projektnumre 689813 og 16103414).
Materials
| Polystyrene particles | Spherotech | PP-20-10 | 2.0-2.4 µm |
| Coverslip | Marienfeld | 0111580 | 18 mm ∅, Thickness No. 1 |
| Ethanol | Scharlau | ET00021000 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P9155 | mol wt 70,000-150,000 |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Glutaraldehyde solution, 50% | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| PBS | Sigma | P3813 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| EDTA Disodium Salt, 2-hydrate | Gold biotechnology | E-210-500 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| anti-Anabaena FtsZ antibody | Agrisera | AS07217 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Life Technologies | A-21039 | conjugated with Alexa Fluor 750 |
| D-Glucose Anhydrous | Fisher Scientific | D16-1 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Methyl Viologen | Sigma-Aldrich | 856177 | |
| Cyclooctatetraene | Sigma-Aldrich | 138924 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | 646547 | |
| Glucose Oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| XD-300 Xenon light source | 250 W | ||
| STORM microscope | NBI | SRiS microscope | |
| Rohdea | NBI | SRiS 3.0 | software for imaging acquisition |
| Luna | NBI | SRiS 3.0 | software for drifting correction |
| QuickPALM | https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis | ||
| 3D Viewer | http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&category=Home |
References
- Huang, B., Babcock, H., Zhuang, X. Breaking the diffraction barrier: Super-resolution imaging of cells. Cell. 143 (7), 1047-1058 (2010).
- Toomre, D., Bewersdorf, J. A New Wave of Cellular Imaging. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 285-314 (2010).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods Methods. 8 (12), 1027-1036 (2012).
- Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Komis, G., Šamajová, O., Ovečka, M., Šamaj, J. Super-resolution Microscopy in Plant Cell Imaging. Trends in Plant Science. 20 (12), 834-843 (2015).
- Schubert, V. Super-resolution Microscopy – Applications in Plant Cell Research. Frontiers in Plant Science. 8, 531 (2017).
- Liu, R., et al. Three-Dimensional Superresolution Imaging of the FtsZ Ring during Cell Division of the Cyanobacterium Prochlorococcus. mbio. 8 (6), e00657 (2017).
- Adams, D. W., Errington, J. Bacterial cell division: assembly, maintenance and disassembly of the Z ring. Nature Reviews Microbiology. 7, 642-653 (2009).
- Boer, P. A. Advances in understanding E. coli cell fission. Current Opinion in Microbiology. 13 (6), 730-737 (2010).
- Moore, L. R., Post, A. F., Rocap, G., Chisholm, S. W. Utilization of different nitrogen sources by the marine cyanobacteria Prochlorococcus and Synechococcus. Limnology and Oceanography. 47 (4), 989-996 (2002).
- Zhao, T., et al. A user-friendly two-color super-resolution localization microscope. Optics Express. 23 (2), 1879 (2015).
- Henriques, R., Lelek, M., Fornasiero, E. F., Valtorta, F., Zimmer, C., Mhlanga, M. M. QuickPALM: 3D real-time photoactivation nanoscopy image processing in ImageJ. Nature Methods. 7 (5), 339-340 (2010).
- Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ. BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).
- Ting, C. S., Rocap, G., King, J., Chisholm, S. W. Cyanobacterial photosynthesis in the oceans: The origins and significance of divergent light-harvesting strategies. Trends in Microbiology. 10 (3), 134-142 (2002).
- Biller, S. J., Berube, P. M., Lindell, D., Chisholm, S. W. Prochlorococcus: The structure and function of collective diversity. Nature Reviews Microbiology. 13 (1), 13-27 (2015).
- Morel, A., Ahn, Y. -. H., Partensky, F., Vaulot, D., Claustre, H. Prochlorococcus and Synechococcus – a Comparative-Study of Their Optical-Properties in Relation To Their Size and Pigmentation. Journal of Marine Research. 51, 617-649 (1993).
- Holden, S. J., Pengo, T., Meibom, K. L., Fernandez, C., Collier, J., Manley, S. High throughput 3D super-resolution microscopy reveals Caulobacter crescentusin vivo Z-ring organization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (12), 4566-4571 (2014).
- Zhao, M., Wei, B., Chiu, D. T. Imaging multiple biomarkers in captured rare cells by sequential immunostaining and photobleaching. Methods. 64 (2), 108-113 (2013).
- Golcuk, K., Mandair, G. S., Callender, A. F., Sahar, N., Kohn, D. H., Morris, M. D. Is photobleaching necessary for Raman imaging of bone tissue using a green laser?. Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (7), 868-873 (2006).
- Haxo, F. T., Blinks, L. R. Photosynthetic Action Spectra of Marine Algae. The Journal of General Physiology. 33 (4), 389-422 (1950).
- Bryant, D. A. Phycoerythrocyanin and Phycoerythrin: Properties and Occurrence in Cyanobacteria. Journal of General Microbiology. 128 (4), 835-844 (1982).
