В этой статье мы демонстрируем, как выполняется абсорбирующий microbiopsy техника и как образец может использоваться для РНК добыча для простых и одновременной выборки кожи и кровь в минимально инвазивной манере.
Биопсия кожи обычных ограничивает клинических исследований, которая включает косметически чувствительных областях или педиатрического приложений из-за его инвазии. Здесь мы описываем протокол для использования абсорбирующего дерма-устройством на базе, абсорбирующего microbiopsy, для малоинвазивных проб смеси кожи и крови. Наша цель – помочь облегчить достижение быстрого прогресса в клинических исследованиях, создании биомаркеров для заболевания кожи и снижение риска для участников клинических исследований. В отличие от обычных кожи биопсии методов абсорбирующего microbiopsy может быть выполнена в течение нескольких секунд и не требует интенсивного обучения из-за своей простой конструкции. В настоящем докладе мы описывают использование поглощающей microbiopsy, включая погрузку и приложения на добровольцев. Затем мы покажем, как изолировать РНК из всасывается образца. Наконец мы продемонстрировать использование количественных обратной транскрипции ПЦР (RT-ПЦР) для количественной оценки выражения уровни mRNA крови (CD3E и CD19) и кожи (KRT14 и TYR). Методы, которые мы опишем используют покинуть шельфа наборы и реагенты. Этот протокол предлагает минимально инвазивной подход для одновременной выборки кожи и крови в пределах той же абсорбирующий microbiopsy матрицы. Мы нашли человеческой этики комитетов, клиницистов и добровольцев в поддержку этого подхода к дерматологические исследования.
Биопсия кожи является одним из важнейших методов в дерматологии для кожи выборки и последующего Диагностика кожных заболеваний через гистопатологические оценки. Биопсия техника включает медицинский работник, удаление подозрительных поражений на коже пациента на обследование1с помощью биопсии лезвия или удар. Хотя этот метод является эффективным, это очень инвазивных и ограничивает клинических исследований, как конечная точка обычно включает в себя методы молекулярной биологии2,3. Молекулярный анализ кожных заболеваний имеет потенциал для обеспечения весьма специфический биологическую информацию, что гистопатологические анализа нельзя, способствуя тем самым наркотиками открытий и болезни диагноз4,5. Кроме того образец спросом в самых молекулярных методов сравнительно мала и может привести к сокращению использования животных и разрешить большее количество реплицирует. Таким образом, существует явная необходимость альтернативный метод, который позволяет молекулярного анализа в клинических исследованиях и снижает риск для участников.
Для удовлетворения такой потребности в области, наша группа разработала Роман дерма-платформа на основе диагностики, абсорбирующего microbiopsy, что позволяет коллекцию малюсенькое количество кожи, смешанные с кровью в простой и минимально инвазивной6. Цель этой публикации заключается в описания абсорбирующий microbiopsy как инструмент выборки для облегчения молекулярного анализа через РНК добыча в клинических исследованиях.
Ранее мы описали первую версию microbiopsy, microbiopsy кожи, которая состоит из микроиглы, изготовлена из листовой трехслойный дизайн для извлечения крошечные кусочки тканей кожи7. Новизна этого устройства происходит от нескольких контактных пунктов от микроиглы, позволяющий эффективно ткани добычи3. В противоположность этому биопсия кожи круговой удар обеспечивает только одну точку контакта и просто слезы кожи без захвата любой образец, в некоторых случаях. Основываясь на microbiopsy кожи, мы недавно разработали абсорбирующий microbiopsy, который имеет крови и кожи, отбор возможностей. Устройство было показано, быть осуществимым для использования в бедных ресурсами районах в последние эпидемиологические исследования6.
Благодаря своей простой конструкции абсорбирующего microbiopsy может быть выполнена в течение нескольких секунд и не требуют обширной подготовки. Кроме того местная анестезия не требуется, и сайт приложения не вызывает рубцевания. Настоящий Протокол позволяет исследователям или медицинских специалистов без соответствующей выборки, обучение для получения данных целевых кожи для молекулярного анализа. Мы ожидаем, microsampling устройства, чтобы стать обычной практикой в исследовании кожи в будущем.
Хотя microbiopsy уже сообщалось в других исследований болезни кожи, которые вовлечены молекулярные методы диагностики6,8,9,10, такие как вирус папилломы человека ДНК обнаружения, этот протокол является первым, чтобы продемонстрировать детали образца добычи и обработки методов для поглощающей microbiopsy. Кроме того это первый доклад, описывающий профилирование выражение гена относительного кожи и клетки крови в microbiopsy образцах.
Эти результаты показывают, что поглощающей microbiopsy может использоваться как инструмент для простых и минимально инвазивной выборки в кожу и кровь смеси для молекулярная характеристика. Приложения для устройства в соответствии с нашей протокол имеет важное значение для получения надежных результатов, как показано на разницу в количестве РНК, восстановленные с различных прикладных протоколов (рис. 3). После извлечения образца последующих образец обработки шаг для РНК добыча очень похож на установленные протоколы15,16. Кроме того от первых шагов в РНК добыча измененные для поглощающей microbiopsy, другим ключевым изменением является использование РНКазы свободной воды, чтобы улучшить результаты для нисходящие приложения. Кроме того стоит отметить, что ген ссылки, используемые в данном исследовании является RPLP0. RPLP0, функция которого хорошо известны для различных клеток и тканей типы17, было сообщено, как ген подходящую ссылку для использования в не Меланома кожи рак и предраковые18.
Одним из основных ограничений устройства является удаление microbiopsy из устройства, которое занимает много времени и потенциально увеличивает вероятность потери образца, особенно для чувствительных проб как РНК. Тем не менее проблемы могут быть преодолены путем предварительного охлаждения стерильной обработки инструменты, такие как трубы microcentrifuge 2мл, по сухим льдом.
Использование поглощающей microbiopsy прост и не требует интенсивного обучения. Обычные биопсии не является необходимым, как microbiopsy позволяет молекулярная характеристика с установленным молекулярной диагностики методы, такие как RT-ПЦР. Для дальнейшего количественного определения и продемонстрировать способность проб абсорбирующий microbiopsy, было расследовано предыдущих литературы, что извлечение RNA от ткани кожи человека. От типичной 3.0, или 4.0 мм кожи пробивать биопсии, три исследования сообщили извлеченные РНК суммы варьировались от 50 до 200 нг на мг кожи ткани19,,2021. Сравнение с 1,43 нг РНК, которая была восстановлена из абсорбирующей microbiopsy в среднем (рис. 3), вес пробы кожных тканей ожидается в диапазоне от 0,29-115 мкг на основе той же пропорции РНК ткани из исследования биопсия кожи удар.
Этот протокол является не без потенциальные ловушки, хотя некоторые проблемы могут быть легко преодолены. Так, например РНК добыча данных предложил значительные различия даже с течением времени проведения 10-s (Рисунок 3). Для решения этой проблемы, одно из возможных решений включает в себя оптимизацию протокола приложения. Такие параметры, как силы применяется к коже и время выдержки следует протестированы и оптимизированы, чтобы уменьшить колебания в пример извлечения. Другой потенциальной проблемой является устранение microbiopsy от устройства, которое может повлиять на целостность образца и восстановления. Хотя удаление microbiopsy для извлечения РНК является эффективным подходом, вся процедура является утомительным и образца могут подвергаться воздействию загрязнения в процессе. Таким образом модификации протокола обработки образца весьма желательно для обеспечения целостности образца и предотвращения потери образца.
После выше двух вопросов, ожидается, что устройство станет стандартным инструментом для клинических исследований. Важно отметить, что устройство захватывает кожу и крови одновременно, и это следует учитывать при анализе данных выражения гена. В заключение этот протокол описывает детали выполнения абсорбирующий microbiopsy как инструмент легко и минимально инвазивных для комбинированной кожи и проб крови и последующие образец обработки для относительной ген выражение профилирования.
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы признать NHMRC стипендии APP1109749 и APP1111216, университет Квинсленда столетия стипендии и международной стипендии последипломного исследований.
Absorbent microbiopsy fabrication and sampling | |||
Absorbent Microbiopsy | Trajan Scientific and Medical | N/A | https://www.trajanscimed.com/ |
Whatman filter paper, Grade 1 | Sigma Aldrich | WHA1001325 | N/A |
RNA extraction | |||
PicoPure RNA Isolation Kit | ThermoFisher | KIT0214 | Including all buffer soltuions described in protocol |
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher | 10977015 | Improving RNA quality in RNA elution step |
2.0 mL Microcentrifuge Tube, Sterile | Thomas Scientific | 1226S74 | N/A |
Microcentrifuge 5415R | Eppendorf | Z605212 | N/A |
cDNA synthesis | |||
SensiFAST cDNA Synthesis Kit | Bioline | BIO-65053 | N/A |
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855196 | N/A |
qPCR reaction and data analysis | |||
SensiFAST SYBR Lo-ROX Kit | Bioline | BIO-94005 | Including reagents described in qPCR reaction steps |
MicroAmp Optical Adhesive Film | ThermoFisher Scinentific | 4311971 | N/A |
MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate | ThermoFisher Scinentific | 4343370 | N/A |
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | ThermoFisher Scinentific | 4485694 | N/A |
GraphPad Prism (v6.04) | GraphPad | N/A; Windows version | Plotting and statistical analysis in qPCR data analysis steps |
PCR primers | |||
RPLP0 F | Sigma Aldrich | N/A | ATC AAC GGG TAC AAA CGA GTC |
RPLP0 R | Sigma Aldrich | N/A | CAG ATG GAT CAG CCA AGA AGG |
TYR F | Sigma Aldrich | N/A | TCA GCA CCC CAC AAA TCC TAA |
TYR R | Sigma Aldrich | N/A | AAT CGG CTA CAG ACA ATC TGC |
KRT14 F | Sigma Aldrich | N/A | CCT CCT CCC AGT TCT CCT |
KRT14 R | Sigma Aldrich | N/A | ACA CCA CCT TGC CAT CG |
CD3E F | Sigma Aldrich | N/A | CAA AGG GGA CAA AAC AAG GAG |
CD3E R | Sigma Aldrich | N/A | GTT CTC CAG AGG GTC AGA TG |
CD19 F | Sigma Aldrich | N/A | TTC TGC CTG TGT TCC CTT G |
CD19 R | Sigma Aldrich | N/A | GCG TCA CTT TGA AGA ATC TCC T |