להעשיר ולהרחיב בתאי T אנטיגן ספציפי נדיר עם חלקיקים מגנטיים
Summary
תאי T אנטיגן ספציפי קשים לאפיין או לנצל טיפולים עקב שלהם בתדר נמוך מאוד. במסמך זה, אנו מספקים פרוטוקול לפתח חלקיק מגנטי אשר ניתן לאגד בתאי T אנטיגן ספציפי כדי להעשיר תאים אלה ולאחר מכן להרחיב אותם כמה פי100 אפיון וטיפול.
Abstract
פיתחנו כלי הן להעשיר ולהרחיב את תאי T אנטיגן ספציפי. הדבר יכול להיות שימושי במקרים כגון א) להבחין בקיומה של תאי T אנטיגן ספציפי, ב) לחקור את הדינמיקה של אנטיגן ספציפי תגובות, ג) להבין כמה תגובות אנטיגן ספציפי משפיעים על מצב מחלה כגון מחלת חיסון עצמי, ד) להזדהותו הטרוגניות תגובות עבור תאי T אנטיגן ספציפי או E) לנצל תאים אנטיגן ספציפי לטיפול. הכלי מבוסס על חלקיקים מגנטיים כי אנחנו נזווג אנטיגן ספציפי של אותות co-stimulatory תא T, כך שאנחנו טווח כמו מלאכותי אנטיגן הצגת תאים (aAPCs). כתוצאה מכך, מאז הטכנולוגיה היא פשוט לייצר, זה יכול בקלות להיות שאומצה על ידי מעבדות אחרות; לכן, המטרה שלנו כאן הוא לתאר בפירוט את ייצור ושימוש עוקבות aAPCs. נסביר כיצד לצרף אותות אנטיגן ספציפי, co-stimulatory aAPCs, כיצד לנצל אותם כדי להעשיר עבור תאי T אנטיגן ספציפי וכיצד להרחיב את תאי T אנטיגן ספציפי. יתר על כן, אנו ידגיש הנדסה עיצוב שיקולים בהתבסס על מידע ניסיוני והביולוגיה של הניסיון שלנו עם אפיון בתאי T אנטיגן ספציפי.
Introduction
עם עליית immunotherapies רבים, יש צורך להיות מסוגלים לאפיין ולשלוט תגובות מערכת החיסון. בפרט, התגובה החיסונית מסתגלת היא עניין בשל ירידה לפרטים העמידות של התאים. לאחרונה, טיפולים chimeric אנטיגן-קולטן תא T אושרו לטיפול בסרטן; עם זאת, אנטיגן-הקולטנים מבוססים הנחה נפוצה תא השטח אנטיגן CD19, במקום אנטיגנים ספציפיים סרטן1. מעבר יחודיות, immunotherapies יכול גם סובלים מחוסר שליטה, ומוגבל להבנת התגובה החיסונית דינאמיים בתוך סרטן או מחלת חיסון עצמי.
הוא אחד האתגרים של הלומדים אנטיגן ספציפי תגובות שלהם בתדר נמוך מאוד, למשל., תאי T אנטיגן ספציפי הם 1 מתוך כל 104 עד 106 T תאים2,3. לפיכך, כדי לחקור איזה T תאים קיימים או להגיב, התאים צריכים להיות מועשר או מורחבת, או האות שלהם צריך להיות מוגבר. זה יקר וקשה לשמור על התאים מזין תוך שימוש בטכניקות הנוכחי פוקוס על ההתרחבות של תאים אנטיגן ספציפי. טכניקות הנוכחי התמקד מגביר את האיתות של אנטיגן ספציפי T תאים, כמו assay מקושרים-אנזים immunospot (ELISPOT), להגביל להשתמש מחדש של התאים אלה T4. לבסוף, בגלל רגישות נמוכה, לעיתים קרובות אלה שתי טכניקות צריך להיות משולבת עבור ספירה אנטיגן ספציפי.
כדי לטפל בבעיות אלה, פיתחנו את מגנטיים מבוססי ננו-חלקיק מלאכותי אנטיגן המציג תא (aAPC)5,6,7,8. יכול להיות functionalized את aAPC עם קומפלקס אנטיגן ספציפי אות-פפטיד טעון histocompatibility הגדולות (pMHC) – ומולקולות co-stimulatory –למשל., נוגדן anti-CD28-לשניהם להעשיר את תאי T אנטיגן ספציפי ולאחר מכן לאחר מכן לעורר התרחבותן (איור 1). החלקיקים ולכן יכול להיות מוצר מדף חסכונית יכול להיות הן אישית כדי שיענה אנטיגן ספציפי stimulations עדיין סטנדרטית על פני ניסויים ומטופלים. ביצוע של העשרה והרחבה לעיבוד תוצאות מאות אלפים קיפול להתרחבות תאי CD8 + T אנטיגן ספציפי ולא יכול לגרום תדרים עד 60 אחוזים לאחר רק שבוע אחד, המאפשר את אפיון או טיפולית השימוש הגדול מספר התאים. במסמך זה, אנו מתארים כיצד ליצור ננו-חלקיק aAPCs, כמה קריטי בעיצוב שיקולים בבחירת המאפיינים ננו-חלקיק, להדגים כמה תוצאות טיפוסיות של ניצול החלקיקים בידוד והרחבת תאי CD8 + T אנטיגן ספציפי נדיר.
Protocol
Representative Results
Discussion
יצרנו טכנולוגיה בידוד תא T אנטיגן ספציפי רומן המבוסס על ננו-חלקיק מלאכותי אנטיגן הצגת תאים (aAPCs). ננו-חלקיק aAPCs יש פפטיד-טעון MHC על פני השטח המאפשר תא T אנטיגן ספציפי קשירה והפעלה לצד הפעלת co-stimulatory. aAPCs גם הם פאראמגנטיים ולאחר ולכן יכול לשמש כדי להעשיר את תאי T אנטיגן ספציפי נדיר, באמצעות שדה מג?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.W.H. תודה מרכז ההדרכה ננוטכנולוגיה של סרטן NIH במכון ג’ונס הופקינס ביוננוטכנולוגיה הלאומית למדע קרן בוגר מחקר לאחווה (DGE-1232825), קרן קשתות לקבלת מלגת תמיכה. עבודה זו מומן על ידי תמיכה של מכוני הבריאות הלאומיים (R21 P01-AI072677, R01-CA108835,-CA185819), יוזמה וחדשנות TEDCO/מרילנד, את קולטר קרן והאמון.
Materials
| DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Human HLA-A2:Ig Fusion Protein | BD Biosciences | 551263 | |
| DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2D[b]:Ig | BD Biosciences | 551323 | |
| DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2K[b]:Ig Fusion Protein | BD Biosciences | 550750 | |
| Vivaspin 20 MWCO 50 000 | GE Life Sciences | 28932362 | |
| Vivaspin 2 MWCO 50 000 | GE Life Sciences | 28932257 | |
| Purified Human Beta 2 Microglobulin | Bio-Rad | PHP135 | |
| nanomag-D-spio, NH2, 100 nm nanoparticles | Micromod | 79-01-102 | |
| Super Mag NHS Activated Beads, 0.2 µm | Ocean Nanotech | SN0200 | |
| Anti-Biotin MicroBeads UltraPure | Miltenyi | 130-105-637 | |
| EZ-Link NHS-Biotin | ThermoFisher | 20217 | |
| Sulfo-SMCC Crosslinker | ProteoChem | c1109-100mg | |
| 2-Iminothiolane hydrochloride | Sigma-Aldrich | I6256 Sigma | |
| 96 Well Half-Area Microplate, black polystyrene | Corning | 3875 | |
| FITC Rat Anti-Mouse Ig, λ1, λ2, & λ3 Light Chain Clone R26-46 | BD Biosciences | 553434 | |
| FITC Mouse Anti-Armenian and Syrian Hamster IgG Clone G192-1 | BD Biosciences | 554026 | |
| B6.Cg-Thy1a/Cy Tg(TcraTcrb)8Rest/J (transgenic PMEL) mice | Jackson Laboratory | 005023 | |
| C57BL/6J (B6 wildtype) mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| CD8a+ T Cell Isolation Kit, Mouse | Miltenyi | 130-104-075 | |
| MS Columns | Miltenyi | 130-042-201 | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Streptavidin-Phycoerythrin, SAv-PE | Biolegend | 405203 | |
| N52 disk magnets of 0.75 inches | K&J Magnetics | DX8C-N52 | |
| APC anti-mouse CD8a Antibody, clone 53-6.7 | Biolegend | 100711 | |
| LIVE/DEAD Fixable Green Dead Cell Stain Kit, for 488 nm excitation | ThermoFisher | L-34969 |
References
- Prasad, V. immunotherapy: Tisagenlecleucel-the first approved Car-t-cell therapy: implications for payers and policy makers. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (1), 11 (2018).
- Jenkins, M. K., Moon, J. J. The role of naive T cell precursor frequency and recruitment in dictating immune response magnitude. The Journal of Immunology. 188 (9), 4135-4140 (2012).
- Rizzuto, G. A., et al. Self-antigen-specific CD8+ T cell precursor frequency determines the quality of the antitumor immune response. Journal of Experimental Medicine. 206 (4), 849-866 (2009).
- Newell, E. W., Davis, M. M. Beyond model antigens: high-dimensional methods for the analysis of antigen-specific T cells. Nature biotechnology. 32 (2), 149 (2014).
- Perica, K., et al. Enrichment and expansion with nanoscale artificial antigen presenting cells for adoptive immunotherapy. ACS nano. 9 (7), 6861-6871 (2015).
- Kosmides, A. K., Necochea, K., Hickey, J. W., Schneck, J. P. Separating T Cell Targeting Components onto Magnetically Clustered Nanoparticles Boosts Activation. Nano Letters. , (2018).
- Hickey, J. W., Vicente, F. P., Howard, G. P., Mao, H. Q., Schneck, J. P. Biologically Inspired Design of Nanoparticle Artificial Antigen-Presenting Cells for Immunomodulation. Nano Letters. 17 (11), (2017).
- , ., et al. Efficient magnetic enrichment of antigen-specific T cells by engineering particle properties. Biomaterials. , (2018).
- Oelke, M., et al. Generation and purification of CD8+ melan-A-specific cytotoxic T lymphocytes for adoptive transfer in tumor immunotherapy. Clinical Cancer Research. 6 (5), 1997-2005 (2000).
- Riccione, K., Suryadevara, C. M., Snyder, D., Cui, X., Sampson, J. H., Sanchez-Perez, L. Generation of CAR T cells for adoptive therapy in the context of glioblastoma standard of care. Journal of visualized experiments: JoVE. (96), (2015).
- Ho, W. Y., Nguyen, H. N., Wolfl, M., Kuball, J., Greenberg, P. D. In vitro methods for generating CD8+ T-cell clones for immunotherapy from the naive repertoire. Journal of immunological methods. 310 (1-2), 40-52 (2006).
- Rudolf, D., et al. Potent costimulation of human CD8 T cells by anti-4-1BB and anti-CD28 on synthetic artificial antigen presenting cells. Cancer immunology, immunotherapy : CII. 57 (2), 175-183 (2008).
- Gulukota, K., Sidney, J., Sette, A., DeLisi, C. Two complementary methods for predicting peptides binding major histocompatibility complex molecules1. Journal of molecular biology. 267 (5), 1258-1267 (1997).
- Castle, J. C., et al. Exploiting the mutanome for tumor vaccination. Cancer research. 72 (5), 1081-1091 (2012).
- Duan, F., et al. Genomic and bioinformatic profiling of mutational neoepitopes reveals new rules to predict anticancer immunogenicity. Journal of Experimental Medicine. 211 (11), 2231-2248 (2014).
- Srivastava, P. K., Duan, F. Harnessing the antigenic fingerprint of each individual cancer for immunotherapy of human cancer: genomics shows a new way and its challenges. Cancer Immunology, Immunotherapy. 62 (5), 967-974 (2013).
- Yadav, M., et al. Predicting immunogenic tumour mutations by combining mass spectrometry and exome sequencing. Nature. 515 (7528), 572 (2014).
- Gros, A., et al. Prospective identification of neoantigen-specific lymphocytes in the peripheral blood of melanoma patients. Nature medicine. 22 (4), 433 (2016).
