Fluorescerende sølv farging av proteiner i polyakrylamid Gels

Summary

Her beskriver vi en detaljert protokoll beskriver en ny fluorescerende flekker teknikk for totalt proteinet oppdagelsen i polyakrylamid gels. Protokollen bruker en sølv ion-spesifikke fluorescens turn-on sonde, som oppdager Ag⁺-protein komplekser, og eliminerer visse begrensninger av tradisjonelle kromogent sølv flekker.

Abstract

Sølv flekker er en kolorimetrisk teknikk brukte å visualisere protein band i polyakrylamid gels etter natrium dodecyl sulfat-polyakrylamid gel geleelektroforese (SDS-side). Klassisk sølv flekker har visse ulemper, som høy bakgrunnsfarge flekker, dårlig protein utvinning, lav reproduserbarhet, en smal lineær dynamiske området for kvantifisering og begrenset kompatibilitet med massespektrometri (MS). Nå, med bruk av en fluorogenic Ag⁺ sonde, TPE-4TA, vi utviklet fluorescerende sølv flekker metode for totalt protein effekten i polyakrylamid gels. Denne nye flekken unngår plagsom sølv reduksjon trinnet i tradisjonelle sølv flekker. Videre viser fluorescerende sølv flekken god reproduserbarhet, følsomhet og lineær kvantifisering i proteinet oppdagelsen, gjør det en nyttig og praktisk protein gel flekk.

Introduction

Mange flekker metoder har blitt brukt til å visualisere proteiner følgende gel geleelektroforese, for eksempel bruker kolorimetrisk fargestoffer som Coomassie briljant blå, sølv flekken, fluorescens eller radioaktivt merking^{1,2, 3 , 4}. sølv flekker anses å være en av de mest følsomme teknikkene for proteinet oppdagelsen som trenger enkel og billig reagenser. Det kan kategoriseres i to store familier: ammoniacal sølv flekken og sølv nitrat flekken^5,6. I alkalisk ammoniacal sølv metoden, er sølv-diamine komplekset produsert med ammoniakk og natriumhydroksid og redusert til metallic sølv under utvikling ved hjelp av en syrlig formaldehyd løsning. Flekken passer effektivt for grunnleggende proteiner, men viser en kompromittert ytelsen for syreholdig og nøytralt proteiner og er videre begrenset til klassisk glysin og taurine electrophoretic systemer. Sammenligning Sølvnitrat flekker utnytter det høy bio-affinitet sølv ioner protein, hovedsakelig av sulfhydryl og carboxyl grupper fra siden kjedene, og pleier å flekken surt proteiner mer effektivt⁷. Etter sølv ion binding, en utvikling løsning (vanligvis laget av en metall karbonat løsning som inneholder formaldehyd og natrium thiosulphate) brukes til å redusere sølv ioner metallisk sølv korn, som bygger opp en brunt til mørkt farge å visualisere den protein band.

Selv om sølv flekker har vært kjent for sin allsidighet og høy følsomhet siden utviklingen i 1970-tallet⁸, er metoden ofte ansett som vanskelig. Sølv flekker metoder har tid-begrenset trinn og viser lav reproduserbarhet. Siden fargen på sølv stain ikke er vanligvis uniform og avhengig av reduksjon-trinnet, som er vanskelig å kontrollere, sølv flekken er ikke en kvantitativ metode og, derfor, anbefalt ikke for gel sammenligning studier og protein kvantifisering⁹. Metoder optimert i følsomhet kan benytte aldehyder som gir også en mer enhetlig flekker¹⁰. Dette er imidlertid på bekostning av videre nedstrøms analyse på grunn av crosslinking proteiner av aldehyder. Rask protokoller hovedsakelig kombinere eller kortere for å redusere tiden, at reproduserbarhet og ensartethet av flekken⁵. Derfor finnes det mange sølv flekker varianter i protein gel flekker, hver optimalisert for å passe visse krav; for eksempel enkelhet, følsomhet eller peptid utvinningsgrad for nedstrøms. Disse attributtene kan også ha innvirkning på hverandre, og oppfyller alle krav i én protokoll kan være vanskelig.

I dette arbeidet introduserer vi en ny fluorescerende sølv flekker metode for proteinet oppdagelsen i polyakrylamid gel. I denne metoden bruker vi en fluorogenic sonde for sølv ioner, TPE-4TA (figur 1), visualisere sølv-impregnert proteiner¹¹. TPE-4TA er designet av aggregering-indusert utslipp (AIE) prinsippet. Det er ikke-emissive når oppløst i vandig løsning, men er svært emissive i nærvær av sølv ioner. Erstatter kromogent utviklingen i tradisjonelle sølv flekker med en fluorogenic utvikle trinn, gjør fluorescerende sølv metoden den robuste flekker av totale proteiner med redusert bakgrunn.

Videre fluorescerende sølv flekken viste en god lineær dynamikk for protein kvantifisering, som er sammenlignbare med brukte SYPRO Ruby flekken og ikke oppnåelig med tradisjonelle sølv flekker. Gelen kan avbildes på brukte gel dokumentasjonssystemer med en ultrafiolett lampe (eksitasjon bølgelengde: 302/365 nm kanal, utslipp: ~ 490-530 nm) på mange biologiske laboratorier.

Protocol

1. forberedelse av Gel Merk: Demonstrasjonen følger en standardprotokoll for å forberede gel flekker etter SDS-side12. I korte trekk følgende beskriver utarbeidelse av prøvene og gel geleelektroforese. Utføre SDS-side med 4% – 12% Bis-Tris protein gels (1 mm, 15-vel) ved hjelp av en mini gel tank fylt med 2-(N -morpholino) ethanesulfonic syre (MES) buffer. Fortynne prøvene med en blanding av destillert vann, litium dodecyl sulfate (LDS…

Representative Results

Protein bandene farget av fluorescerende sølv flekken forevise en intens grønne fluorescens under en 365 nm UV-lampe. Alle 14 protein band (10-200 kDa), var fra topp til bunn, tydelig, samkjøre godt med de 14 rød-farget farget av SYPRO Ruby fargestoff (figur 2)10. Når det gjelder kvantitativt proteinet oppdagelsen, geléer ble fotografert av en gel imaging system som bru…

Discussion

Presenteres her er romanen fluorescerende sølv flekker metode for proteiner i polyakrylamid gels. Denne strategien integrerer konvensjonell sølv flekker og fluorescerende flekker. Farging bedriftene selektiv binding av sølv ion proteiner som andre sølv flekker, men bruker svært sensitive fluorogenic sølv sonde TPE-4TA å lyse opp en bundet proteiner. Siden fluorogenic sonden TPE-4TA kan forstand sølv ioner i en relativt lav konsentrasjon i nanomolar området^11</s…

Materials

LDS Sample Buffer (4X)	Thermo Fisher Scientific	NP0007	Reagent
4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well	Thermo Fisher Scientific	NP0323BOX	Precast gel
Sample Reducing Agent (10X)	Thermo Fisher Scientific	NP0004	Reagent
MES SDS Running Buffer (20X)	Thermo Fisher Scientific	NP0002	Reagent
Mini Gel Tank	Thermo Fisher Scientific	A25977	Equipment
300W Power Supply (230 VAC)	Thermo Fisher Scientific	PS0301	Equipment
Unstained Protein Ladder	Thermo Fisher Scientific	26614	Sample
Silver nitrate	Sigma-Aldrich	31630-25G-R	Reagent
Ethanol	Bragg and co.	42520J	Reagent
Acetic acid	J.T. Baker	103201A	Reagent
Milli-Q Synthesis A10	Merk	–	Provides 18.2 MΩ.cm water
gel documentation system (c600 model)	Azure biosystems	–	Equipment