Fluorescente macchiatura d'argento delle proteine nel gel di poliacrilammide

Summary

Qui, descriviamo un protocollo dettagliato che delinea una fluorescente nuova tecnica per la rilevazione di proteine totali in gel di poliacrilammide di pittura. Il protocollo utilizza una sonda d’argento dello ione specifico fluorescenza accensione, rileva Ag⁺-complessi della proteina ed Elimina alcune limitazioni dei tradizionali cromogeniche macchie d’argento.

Abstract

Macchiatura d’argento è una tecnica colorimetrica ampiamente utilizzata per visualizzare le bande proteiche in gel di poliacrilammide dopo elettroforesi del gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE). Le macchie d’argento classiche hanno alcuni inconvenienti, come alta priorità bassa che macchia, recupero di proteina povera, scarsa riproducibilità, una gamma dinamica lineare stretta per la quantificazione e la limitata compatibilità con spettrometria di massa (MS). Ora, con l’uso di una sonda di fluorogenic Ag⁺ , TPE-4TA, abbiamo sviluppato un fluorescente argento che macchia il metodo per la visualizzazione di proteine totali in gel di poliacrilammide. Questa nuova macchia evita il passaggio di riduzione d’argento fastidioso in tradizionali macchie d’argento. Inoltre, la macchia d’argento fluorescente dimostra buona riproducibilità, sensibilità e quantificazione lineare nella rilevazione della proteina, rendendolo una macchia di gel di proteina utile e pratico.

Introduction

Molti metodi di colorazione sono state usate per visualizzare proteine elettroforesi su gel in seguito, ad esempio utilizzando coloranti colorimetrici come Coomassie Brilliant Blue, macchia d’argento, fluorescenza, o radioattivo etichettatura^{1,2, 3 , 4}. macchiatura d’argento è considerata una delle tecniche più sensibili per la rilevazione di proteine che richiedono reagenti semplici ed economici. Possono essere classificato in due famiglie principali: la macchia d’argento ammoniacale e il nitrato d’argento macchia^5,6. Nel metodo d’argento ammoniacale alcalino, il complesso di argento-diammina è prodotta con idrossido di sodio e ammoniaca e ridotto ad argento metallico durante lo sviluppo utilizzando una soluzione di formaldeide acide. La macchia può ospitare in modo efficiente per proteine basiche ma mostra una prestazione compromessa per le proteine acide e neutre ed è, inoltre, limitata ai sistemi elettroforetiche della taurina e glicina classica. In confronto, le macchie di nitrato d’argento sfruttano l’alta bio-affinità degli ioni d’argento per proteine, principalmente la solfidrilico e carbossilico gruppi da catene laterali e tendono a macchiare le proteine acide in modo più efficiente⁷. Dopo agli ioni d’argento vincolante, una soluzione in via di sviluppo (in genere in una soluzione di carbonato di metallo contenente formaldeide e sodio tiosolfato) viene applicata per ridurre gli ioni d’argento a grani d’argento metallici, che costruire un colore marrone-scuro per visualizzare la fasce della proteina.

Sebbene macchiatura d’argento è stato ben nota per la sua versatilità e l’alta sensibilità dal suo sviluppo nel 1970s⁸, il metodo è spesso considerato come difficile. Metodi di colorazione argento hanno passaggi di tempo-limitato e mostrano scarsa riproducibilità. Poiché il colore della macchia d’argento non è solitamente uniforme e dipende il passo di riduzione, che è difficile da controllare, la macchia d’argento non è un metodo quantitativo e, quindi, non raccomandato per gel confronto studio e proteina quantificazione⁹. Metodi ottimizzati nella sensibilità possono utilizzare aldeidi che possono anche fornire un aspetto più uniforme colorazione¹⁰. Tuttavia, questo è a scapito di ulteriore analisi a valle a causa la reticolazione delle proteine di aldeidi. Protocolli di veloce principalmente combinano o accorciano alla seguente procedura per ridurre il tempo di compromettere la riproducibilità e l’uniformità della macchia⁵. Di conseguenza, ci sono numerosi argento colorazione varianti all’interno di gel di proteina che macchia, ciascuno ottimizzato per soddisfare determinati requisiti; ad esempio, semplicità, sensibilità o peptide tasso di recupero per analisi a valle. Questi attributi possono anche avere un impatto su ogni altro, e soddisfare tutte le esigenze in un protocollo può essere difficile.

In questo lavoro, vi presentiamo un nuovo fluorescente argento che macchia il metodo per la rilevazione di proteine nel gel di poliacrilammide. In questo metodo, utilizziamo una sonda fluorogenic per ioni d’argento, TPE-4TA (Figura 1), per visualizzare le proteine impregnato di argento¹¹. TPE-4TA è stato progettato dal principio di emissione indotta da aggregazione (AIE). È non-emissivo quando disciolto in soluzione acquosa, ma è altamente emissivo in presenza di ioni d’argento. Sostituendo lo sviluppo cromogeno in tradizionali macchie d’argento con un fluorogenic sviluppando passo, il metodo d’argento fluorescente consente la macchiatura robusta delle proteine totali con uno sfondo ridotto.

Inoltre, la macchia d’argento fluorescente ha mostrato una buona gamma dinamica lineare per quantificazione della proteina, che è paragonabile con la macchia di SYPRO Ruby ampiamente utilizzato e non ottenibile con le macchie d’argento tradizionale. Il gel può essere ripreso il gel comunemente utilizzati sistemi di documentazione con lampada a raggi ultravioletti (lunghezza d’onda di eccitazione: canale di 302/365 nm; emissione: ~ 490-530 nm) presso molti laboratori biologici.

Protocol

1. preparazione del Gel Nota: La dimostrazione segue un protocollo standard per preparare il gel per la colorazione poco dopo SDS-PAGE12. In breve, i passaggi seguenti descrivono la preparazione dei campioni e l’elettroforesi del gel. Eseguire SDS-PAGE con gel di proteina 4% – 12% Bis-Tris (1 mm, 15-bene) usando un carro armato del gel mini riempiti di 2-(N -morfolino) buffer di ethanesulfonic acido (MES). Diluire i campioni con una miscela …

Representative Results

Le bande proteiche macchiate dalla macchia d’argento fluorescente presentano una fluorescenza verde intensa sotto una lampada a UV 365 nm. Tutte le bande di proteina 14 (10-200 kDa), da cima a fondo, erano chiaramente visibili, che correlano bene con 14 quelli colore rosso macchiati dalla SYPRO Ruby tintura (Figura 2)10. Per quanto riguarda la rilevazione quantitativa della p…

Discussion

Presentato qui è un romanzo fluorescente argento che macchia il metodo per le proteine nel gel di poliacrilammide. Questa strategia integra le macchie d’argento convenzionale e la colorazione fluorescente. Le gesta di colorazione il legame selettivo di ioni d’argento per proteine come in altri argento macchie ma impiega un argento altamente sensibile fluorogenic sonda TPE-4TA per illuminare le proteine rilegate d’argento. Poiché la sonda fluorogenic TPE-4TA può percepire gli ioni d’ar…

Materials

LDS Sample Buffer (4X)	Thermo Fisher Scientific	NP0007	Reagent
4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well	Thermo Fisher Scientific	NP0323BOX	Precast gel
Sample Reducing Agent (10X)	Thermo Fisher Scientific	NP0004	Reagent
MES SDS Running Buffer (20X)	Thermo Fisher Scientific	NP0002	Reagent
Mini Gel Tank	Thermo Fisher Scientific	A25977	Equipment
300W Power Supply (230 VAC)	Thermo Fisher Scientific	PS0301	Equipment
Unstained Protein Ladder	Thermo Fisher Scientific	26614	Sample
Silver nitrate	Sigma-Aldrich	31630-25G-R	Reagent
Ethanol	Bragg and co.	42520J	Reagent
Acetic acid	J.T. Baker	103201A	Reagent
Milli-Q Synthesis A10	Merk	–	Provides 18.2 MΩ.cm water
gel documentation system (c600 model)	Azure biosystems	–	Equipment