Nous décrivons ici un protocole pour l’immunoprécipitation de la chromatine efficace (ChIP) suivi par séquençage haut-débit (ChIP-seq) du tissu adipeux brun (TAB) isolé à partir d’une souris. Ce protocole est convenable pour les cartographie des modifications d’histone et enquêter sur tout le génome de localisation des protéines non histones d’intérêt in vivo.
Processus plus cellulaires sont réglementées par transcriptional modulation de programmes spécifiques de gènes. Cette modulation est obtenue par l’action combinée d’un large éventail de facteurs de transcription (TFs) et cofacteurs médiation activation de la transcription ou de répression par des changements dans la structure de la chromatine. Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) est une approche de la biologie moléculaire utiles pour la cartographie des modifications d’histone et profilage des facteurs de transcription/cofacteurs liaison à l’ADN, permettant ainsi un aperçu des changements dynamiques nucléaires survenant au cours de différentes processus biologiques.
Afin d’étudier la régulation de la transcription dans le tissu adipeux, les échantillons provenant de cultures de cellules in vitro d’immortalisé ou lignées cellulaires primaires sont souvent favorisées lors d’essais de puce à cause de l’abondance de la matière première et réduit la variabilité biologique. Cependant, ces modèles représentent un instantané limité de l’état réel de la chromatine dans les organismes vivants. Ainsi, il y a un besoin crucial pour les protocoles optimisés effectuer la puce sur des échantillons de tissus adipeux dérivées de modèles animaux.
Nous décrivons ici un protocole pour ChIP-seq efficace des modifications d’histone tant des protéines non histones dans le tissu adipeux brun (TAB) isolé à partir d’une souris. Le protocole est optimisé pour l’étude Génome-large la localisation des protéines d’intérêt et les marqueurs épigénétiques dans la chauve-souris, qui est un tissu morphologiquement et physiologiquement distinct parmi les dépôts de graisse.
Alors que le tissu adipeux blanc (WAT) spécialisé dans le stockage de l’énergie, tissu adipeux brun (TAB) dissipe l’énergie sous forme de chaleur en raison de sa capacité à convertir les glucides et lipides en énergie thermique via mitochondriales découplantes1. En raison de cette fonction spécialisée, le dépôt de chauve-souris est nécessaire pour le maintien de la température du corps dans les conditions physiologiques et en réponse à l’exposition au froid. Tandis que les modifications de l’expression génique au cours de la différenciation de la chauve-souris et sur stress thermogène ont été intensivement étudiées in vivo et in vitro, les mécanismes moléculaires qui sous-tendent ces changements ont surtout été disséqué en lignées cellulaires immortalisées et primaire pré-adipocytes, à l’exception de plusieurs études in vivo2,3,4,5.
Réglementation des programmes d’expression de gènes spécifiques par le biais de régulation transcriptionnelle est obtenue par changements coordonnés dans la chromatine structure via transcription divers facteurs et facteurs conjointement des actions. Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) est une approche de la biologie moléculaire précieux pour enquêter sur le recrutement de ces facteurs à l’ADN et les modifications connexes dans le paysage de la chromatine par profilage. Les facteurs clés du succès des expériences de puce incluent optimisations des conditions de réticulation et la chromatine cisaillement cohérence tout au long des échantillons différents, disponibilité du matériel de départ adéquat et, surtout, la qualité des anticorps. Si la puce de tissus entiers, il est également important de tenir compte de l’hétérogénéité des échantillons et d’optimiser le protocole pour améliorer l’efficacité de l’isolement des noyaux, ce dernier étant une étape particulièrement sensible lorsque vous travaillez avec le tissu adipeux due à la teneur en lipides élevés. En fait, les techniques d’isolation moléculaire de dépôts adipeux ensemble sont compliquées par la présence de niveaux élevés de triglycérides, et les protocoles doivent être optimisés pour augmenter la quantité d’isolement de la chromatine. Enfin, lorsque le séquençage haut-débit est effectué après l’isolement de l’ADN-ChIP, la profondeur de séquençage est essentielle pour déterminer le nombre de pics qui sont détectés en toute confiance.
Ici, nous nous référons aux étalons de travail et des orientations générales pour les expériences de ChIP-seq recommandés par le consortium ENCODE et modENCODE6 pour les meilleures pratiques, et nous nous concentrons sur une description étape par étape d’un protocole optimisé pour ChIP-seq de BAT. Le protocole décrit permet une isolation efficace de la chromatine du tissu adipeux pour effectuer le séquençage du génome pour facteurs de liaison à l’ADN avec des pics bien définies ainsi que histone marques avec les signaux plus diffus.
Le protocole décrit ici représente un outil précieux pour l’exécution de puce de tissus murins, spécialement optimisés pour le tissu adipeux brun. Parmi les plus grands défis dans l’accomplissement de morceau de tissu se remet un nombre suffisant de cellules au cours de la préparation de l’échantillon. Tonte la chauve-souris à l’aide d’un mélangeur homogénéisateur de tissu couplé avec des billes en acier inoxydable au lieu d’un pilon de verre canonique significativement réduit le nombre des cel…
Bullet Blender Tissue Homogenizer | Next Advence | BBX24 | |
Stainless Steel Beads 3.2mm Diameter | Next Advence | SSB32 | |
Bioruptor Sonicator | Diagenode | ||
1.5 ml Micro Tube TPX Plastic | Diagenode | C30010010-5 | |
Complete-Protease inhibitor | Roche | 11836145001 | |
Protein A Agarose Slurry | Invitrogen | 101041 | |
GPS2 antibody | In house | Rabbit polyclonal, Ct antibody (Cardamone et al., Mol Cell 2018) | |
Pol2 antibody | Diagenode | C15100055 | |
h3K9me3 antibody | Millipore | 05-1242 | |
Fast Syber Green Master Mix | Aplied Biosytem | 4385612 | |
ViiA7 | Aplied Biosytem | ||
TruSeq ChIP Library Preparation Kit | Illumina | IP-202-1012 | |
HiSeq 2000 | Illumina |