विरोधी mitotic चिकित्सकीय के लिए अपोप्तोटिक प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए DR3 व्यक्त सेल लाइनों की स्थापना
Summary
एक स्थिर सेल ब्याज की जीन को व्यक्त करने के जीन समारोह का अध्ययन लाइन की स्थापना स्थिर अभिकर्मक द्वारा किया जा सकता है उंहें retroviral संक्रमण के माध्यम से transfecting के बाद एकल क्लोन उठा । यहां हम बताते है कि HT29-DR3 सेल इस तरह से उत्पंन लाइनों स्पष्ट तंत्र है जिसके द्वारा मौत रिसेप्टर 3 (DR3) antimitotics प्रेरित apoptosis के लिए योगदान देता है ।
Abstract
रुचि के जीन के कार्य का अध्ययन कर अभिव्यक्ति के अपने स्तर में हेर-फेर से प्राप्त किया जा सकता है, जैसे पछाड़ना कोशिका रेखाओं के साथ अपनी अभिव्यक्ति को कम करना या फिर से व्यक्ती कोशिका रेखाओं के साथ अपनी अभिव्यक्ति बढ़ाना. क्षणिक और स्थिर अभिकर्मक दो तरीके है कि अक्सर exogenous जीन अभिव्यक्ति के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं । क्षणिक अभिकर्मक केवल अल्पकालिक अभिव्यक्ति के लिए उपयोगी है, जबकि स्थिर अभिकर्मक की अनुमति देता है exogenous जीन मेजबान सेल जीनोम में एकीकृत किया जा सकता है जहां यह लगातार व्यक्त किया जाएगा । नतीजतन, स्थिर अभिकर्मक आमतौर पर दीर्घकालिक आनुवंशिक विनियमन में अनुसंधान के लिए कार्यरत है । यहां हम एक सरल प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए एक स्थिर सेल व्यक्त मौत रिसेप्टर 3 (DR3) DR3 समारोह का पता लगाने के लिए लाइन उत्पंन । हम एक retroviral संक्रमण के बाद एक क्लोन उठाया क्रम में एकरूपता और स्थिर सेल लाइनों की पवित्रता बनाए रखने के लिए । इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर उत्पन्न स्थिर सेल लाइनों antimitotic दवाओं के प्रति संवेदनशील DR3 की कमी HT29 कोशिकाओं को रेंडर, इस प्रकार HT29 कोशिकाओं में अपोप्तोटिक प्रतिक्रिया का पुनर्गठन. इसके अलावा, DR3 पर झंडा टैग अच्छा DR3 एंटीबॉडी की उपलब्धता के लिए क्षतिपूर्ति और आणविक तंत्र के जैव रासायनिक अध्ययन की सुविधा है जिसके द्वारा antimitotic एजेंटों apoptosis प्रेरित ।
Introduction
Heterologous जीन अभिव्यक्ति अक्सर ब्याज की जीन के समारोह का अध्ययन करने के लिए कार्यरत है । दो तरीकों, क्षणिक और स्थिर अभिकर्मक, प्रचलित कोशिकाओं में इस्तेमाल किया और आणविक जीव विज्ञान के लिए एक मेजबान सेल1,2में डीएनए या आरएनए के एक खंड डालने के लिए कर रहे हैं । क्षणिक-transfected डीएनए या आरएनए बेटी कोशिकाओं को पारित नहीं किया जा सकता है, तो आनुवंशिक परिवर्तन केवल समय की एक छोटी अवधि के लिए बनाए रखा जा सकता है । दूसरी ओर, छुरा transfected कोशिकाओं में, exogenous जीन मेजबान सेल जीनोम में एकीकृत कर रहे हैं, सेल लाइन में अपनी अभिव्यक्ति को बनाए रखने । इस प्रकार, स्थिर अभिकर्मक एक तरीका है कि आम तौर पर दीर्घकालिक आनुवंशिक विनियमन में अनुसंधान के लिए आरक्षित है । स्थिर सेल लाइन भी vivo अध्ययन3 में के लिए माउस मॉडल में xenografts के रूप में प्रत्यारोपण किया जा सकता है । स्थिर अभिकर्मक दो श्रेणियों में विभाजित किया जा सकता है: वायरल और वायरल । वायरल अभिकर्मक की तुलना में, वायरल संक्रमण एक उच्च दक्षता4,5,6,7के साथ मानव कोशिकाओं की एक व्यापक विविधता में जीन हस्तांतरण कर सकते हैं । इसके अलावा, एक एकल क्लोन से एक स्थिर सेल लाइन सजातीयता और क्लोनिंग शुद्धता का लाभ प्रदान करता है ।
अनियंत्रित कोशिका वृद्धि और विभाजन कैंसर की सबसे विशिष्ठ विशेषताएं हैं । नैदानिक सेटिंग्स में, antimitotic एजेंटों ट्यूमर8के कई प्रकार के लिए प्राथमिक उपचार कर रहे हैं । हालांकि, antimitotic एजेंट्स की कुछ महत्वपूर्ण सीमाओं को अनदेखा नहीं किया जा सकता । सबसे पहले, इन chemotherapies भी अवांछित कैंसर कोशिकाओं के साथ सामान्य कोशिकाओं को मार सकते हैं और, इस प्रकार, गंभीर साइड इफेक्ट में परिणाम कर सकते हैं8. दूसरा, antitubulin दवाओं ट्यूमर के सभी प्रकार के खिलाफ प्रभावी नहीं हैं, एक cytoskeletal प्रोटीन9,10के रूप में विभिंन ऊतकों की एक विस्तृत विविधता में tubulin सर्वव्यापी अभिव्यक्ति के बावजूद । यह स्पष्ट नहीं है क्यों antitubulin एजेंटों डिंबग्रंथि, फेफड़े, और नैदानिक उपचार में रक्त कैंसर, लेकिन गुर्दे, बृहदांत्र, या अग्नाशय के कैंसर11में नहीं के खिलाफ आशाजनक प्रभावकारिता दिखाया । अंत में, ट्यूमर के एक ही प्रकार के साथ भी रोगियों को एक अप्रत्याशित तरीके से अलग antimitotics का जवाब कर सकते हैं । वहां एक प्रमुख प्रभाव अणु कि antimitotic एजेंटों के लिए विभिंन रोगियों की संवेदनशीलता को प्रभावित करता है, विविध नैदानिक उपचार12में देखा परिणामों में जिसके परिणामस्वरूप हो सकता है । इस प्रकार, antimitotic उपचार के लिए रोगियों के संभावित अंतर संवेदनशीलता को ध्यान में रखा जाना चाहिए ताकि चिकित्सीय हस्तक्षेप13को ऑप्टिमाइज़ किया जा सके ।
एक उच्च प्रवाह पूरे जीनोम सिरना पुस्तकालय स्क्रीन का प्रदर्शन किया है कि DR3 पछाड़ना संवेदनशील antimitotic दवाओं के लिए प्रतिरोधी कोशिकाओं, रसायन चिकित्सा में DR3 के लिए एक भूमिका फंसाने-प्रेरित apoptosis14प्रदान सकता है । ट्यूमर परिगलन कारक रिसेप्टर (TNFR) superfamily के एक सदस्य के रूप में, DR3 विभिन्न प्रणालियों15,16,17,18में मध्यस्थता सेल apoptosis के लिए सूचित किया गया है. इस प्रकार, हम बाहर सेट के लिए स्थिर कोशिका DR3 व्यक्त करने के लिए आणविक तंत्र है जिसके द्वारा antimitotic दवाओं apoptosis प्रेरित अध्ययन लाइनों की स्थापना । DR3 एक्सप्रेस का अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त सेल मॉडल मानव बृहदांत्र कैंसर सेल लाइन HT29, जो DR3 की कमी होना पाया गया द्वारा प्रदान किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, क्लिनिक में, बृहदांत्र कैंसर antimitotic ड्रग्स के लिए असंवेदनशील है19।
इस लेख में, हम एक विधि जो retroviral संक्रमण के माध्यम से एक HT29-DR3 स्थिर सेल लाइन की पीढ़ी की अनुमति देता है का वर्णन । हम आगे कैसे पश्चिमी सोख्ता का उपयोग कर इन कोशिकाओं में DR3 अभिव्यक्ति को मांय करने के लिए और कैसे एक सेल व्यवहार्यता परख और रूपात्मक अवलोकन का उपयोग करके antimitotic एजेंटों के लिए संवेदनशीलता का आकलन करने के लिए दिखा । कोशिकाओं को एक क्लोन से परिलक्षित होते है और, इस प्रकार, एक सजातीय आनुवंशिक पृष्ठभूमि का लाभ है । इसके अलावा, DR3 पर झंडा टैग माइक्रोस्कोपी और जैव रासायनिक दृष्टिकोण से जीन अभिव्यक्ति और प्रोटीन बातचीत का विश्लेषण द्वारा सेलुलर DR3 के दृश्य के लिए अनुमति दी । इसके अलावा, कोशिकाओं को चूहों में xenografted जा सकता है आगे vivo14में antimitotics के जवाब में ट्यूमर प्रगति का विश्लेषण ।
HT29-DR3 सेल प्रणाली यहां प्रस्तुत कैसे antimitotics कैंसर कोशिकाओं को मारने के आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक प्रभावी उपकरण की पेशकश14। के बाद से व्यक्त और पछाड़ना सेल लाइनों जीन समारोह का अध्ययन करने के लिए आम उपकरण हैं, इस प्रोटोकॉल ब्याज या अंय सेल लाइनों के अंय जीनों के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है और, इस प्रकार, एक बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया दृष्टिकोण में बदल गया ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस पांडुलिपि में, हम HT29-DR3 स्थिर सेल लाइनों उत्पन्न करने के लिए एक विधि का वर्णन । HT29-DR3 कोशिकाओं आणविक तंत्र है जिसके द्वारा DR3 antimitotic एजेंटों द्वारा प्रेरित apoptosis के लिए योगदान के अध्ययन के लिए एक मॉडल प्रदान क?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के लिए अनुदान ५३११००००११७ (गिनीकृमि) और ०४३२२२०१९ (Tsinghua विश्वविद्यालय से X.W.) द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| DMEM | Invitrogen | C11965500BT | Supplemented with 10% FBS and 1% Penicilin/Streptomycin |
| Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7571 | |
| Paclitaxel | Selleck | S1150 | |
| pMXs-IRES-Blasicidin | Cell Biolabs | RTV-016 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| PBS | Invitrogen | C14190500BT | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Invitrogen | 25200056 | |
| 1,5-Dimethyl-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide | Santa Cruz | sc-134220 | |
| Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| Anti-mouse secondary antibody | |||
| anti-Flag antibody | Sigma | F-3165 | |
| HT29 cell line | ATCC | HTB-38 | |
| plat-A cell line | Cell Biolabs | RV-102 | |
| PVDF Immobilon-P | Millipore | IPVH00010 | |
| Cloning Cylinder | Sigma | C1059 | |
| Cell Imaging Multi-Mode Reader | Biotek | BTCYT3MV | |
| CKX53 Inverted Microscope | Olympus | CKX53 | |
| 12-well cell culture plates | Nest | 712001 | |
| 60 mm cell culture plates | Nest | 705001 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Nest | 601052 | |
| 0.22 μm steril filter | Millipore | SLGP033RB | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5810000327 | |
| 96 Well White Polystyrene Microplate | Corning | 3903 | |
| Western ECL Substrate | BIO-RAD | 1705060 | |
| ImageQuant LAS 4000 | GE Healthcare | ImageQuant LAS 4000 | |
| Decoloring Shaker | HINOTECH | TS-2000A | |
| Blasticidin | InvivoGen | ant-bl-1 | |
| Automated cell counter | BIO-RAD | TC 20 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985070 |
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