Apoptotic 응답 안티 mitotic 치료 학을 평가 하기 위해 DR3 Overexpressing 셀 라인 구축
Summary
Overexpressing 유전자 기능 연구 관심사의 유전자 안정적인 셀 라인 구축 그들에 transfecting 통해 retroviral 감염 후 안정 되어 있는 transfection 따기 단일 클론에 의해 할 수 있습니다. 여기 우리가 HT29 DR3 셀 라인 이런 방식으로 생성 된 메커니즘 수용 체 3 (DR3) antimitotics-유도 된 apoptosis에 기여 하는 어떤 죽음에 의해 명료 하 게 보여줍니다.
Abstract
관심사의 유전자의 기능을 공부 하는 것은 감소 하는 최저의 셀 라인의 식을 overexpression 셀 라인의 식을 증가 등 식의 그것의 수준을 조작 하 여 얻을 수 있습니다. 과도 하 고 안정적인 transfection 외 인 진 식에 자주 사용 되는 두 가지 방법이 있습니다. 과도 transfection는 안정 되어 있는 transfection 있습니다 호스트 세포 게놈으로 통합 외 인 유전자 그것은 지속적으로 표현 될 것입니다 어디에 단기 식에 유용 합니다. 그 결과, 안정 되어 있는 transfection는 보통 채택 연구에 대 한 장기 유전 규칙에. 여기 우리는 overexpressing 태그 죽음 수용 체 3 (DR3) DR3 함수를 탐구 하는 안정적인 셀 라인을 생성 하는 간단한 프로토콜을 설명 합니다. 우리는 동질성과 안정적인 셀 라인의 순수성을 유지 하기 위해 retroviral 감염 후 단일 클론을 선택. 이 프로토콜을 사용 하 여 생성 하는 안정적인 셀 라인 따라서 재구성 HT29 셀에 apoptotic 응답 antimitotic 약물에 민감한 DR3 불충분 한 HT29 셀을 렌더링 합니다. 또한, DR3에 플래그 태그 좋은 DR3 항 체의 불가능에 대 한 보상 하 고는 antimitotic 에이전트 apoptosis를 유도 하는 분자 메커니즘의 생 화 확 적인 연구를 용이 하 게.
Introduction
분리 유전자 발현은 관심사의 유전자의 기능 연구를 종종 고용 된다. 두 가지 방법, 과도 및 안정 되어 있는 transfection, 세포 및 분자 생물학에 prevalently 호스트 셀1,2에 DNA 또는 RNA의 세그먼트를 삽입 하 되. 뚜렷이 transfected DNA 또는 RNA 전달할 수 없습니다 딸 세포에 유전 변경만 시간의 짧은 기간 동안 보존 될 수 있도록. 다른 한편으로, 안정적 transfected 세포, 세 유전자 셀 라인에의 식을 유지 호스트 세포 게놈으로 통합 됩니다. 따라서, 안정 되어 있는 transfection 장기 유전 규칙에 대 한 연구에 대 한 일반적으로 소유 되는 방법입니다. 안정적인 셀 라인 비보에 대 한 마우스 모델에 xenografts 공부3에 이식 수 있습니다. 안정 되어 있는 transfection는 두 가지 범주로 나눌 수 있습니다: 바이러스 및 nonviral. Nonviral transfection에 비해 바이러스 감염 다양 한 높은 효율4,5,,67인간 세포로 유전자를 전송할 수 있습니다. 또한, 하나의 클론에서 안정적인 셀 라인 동질성과 클론 순도의 이점을 제공합니다.
과 통제 세포 성장 암의 가장 구별 특징은. 임상 설정에서 antimitotic 에이전트는 다양 한 유형의 종양8주 치료. 그러나, antimitotic 에이전트의 몇 가지 중요 한 제한이 무시할 수 없습니다. 첫째, 이러한 chemotherapies 또한 원치 않는 암 세포와 정상 세포를 죽 일 수 있다 그리고, 따라서, 심각한 부작용8발생할 수 있습니다. 두 번째, antitubulin 약물 tubulin의 유비 쿼터 스 식 cytoskeletal 단백질9,10다양 다른 조직에에서도 불구 하 고 종양의 모든 종류에 대해 유효 하지 않습니다. 그것은 명확 하지 않습니다 antitubulin 에이전트에 대 한 유망한 효능 보여 난소, 폐, 그리고 신장, 콜론, 또는 췌 장 암11에 임상 치료, 혈액 암. 마지막으로, 심지어 동일한 유형의 종양 환자에 응답할 수 있는 antimitotics 다르게 예측할 수 없는 방식으로. Antimitotic 에이전트, 임상 치료12에서 본 다양 한 결과 결과로 다른 환자의 민감도 영향을 미치는 주요 효과 기 분자를 있을 수 있습니다. 따라서, antimitotic 치료에 환자의 잠재적인 차동 감도 해야 될 고려 치료 개입13를 최적화 하기 위해.
높은 처리량 전체 게놈 siRNA 도서관 화면 DR3 최저 민감한 세포 antimitotic 약물, 화학요법 유도 된 apoptosis14역할 DR3 위한 연루에 저항을 렌더링 수 설명 했다. 종양 괴 사 인자 수용 체 (TNFR) superfamily의 일 원으로, DR3 다양 한 시스템15,16,,1718세포 apoptosis 중재에 보고 되었습니다. 따라서, 우리는 antimitotic 마약 apoptosis를 유도 하는 분자 메커니즘 연구 DR3 overexpressing 안정 셀 라인 구축에 착수. 인간 결 장 암 세포 선 DR3 결핍 발견 했다 HT29 DR3 overexpression 공부에 대 한 적절 한 셀 모델을 제공할 수 있습니다. 또한, 클리닉, 결 장 암 않습니다 민감한 antimitotic 약19.
이 문서에서는, 우리는 retroviral 감염을 통해 HT29 DR3 안정적인 셀 라인의 생성을 허용 하는 방법을 설명 합니다. 우리는 더 DR3 식 부 럽을 사용 하 여 이러한 셀에서의 유효성을 검사 하는 방법과 세포 생존 능력 분석 실험 및 형태학 적 관찰을 사용 하 여 antimitotic 에이전트에 감도 평가 하는 방법을 보여줍니다. 셀 단일 클론에서 증폭 하 고, 따라서, 균질 유전 배경의 이점이 있다. 또한, DR3에 플래그 태그 허용 셀룰러 DR3의 시각화에 대 한 현미경 검사 법 및 유전자 표현과 단백질 상호 작용의 분석에 의해 생 화 확 적인 접근. 또한, 셀 추가 종양 진행 antimitotics vivo에서14에 대 한 응답을 분석 하는 쥐에 xenografted 수 있습니다.
여기에 제시 된 HT29 DR3 셀 시스템 antimitotics 암 세포14를 죽 일 방법의 분자 메커니즘을 공부를 위한 효과적인 도구를 제공 합니다. Overexpression 및 최저의 세포 유전자 기능 연구에 대 한 일반적인 도구 때문에,이 프로토콜 수 관심 또는 다른 셀 라인의 다른 유전자에 쉽게 적응 되며, 따라서, 광범위 하 게 사용 된 접근 방식을 바 뀌.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 원고에서 우리 HT29 DR3 안정적인 셀 라인을 생성 하는 방법을 설명 합니다. HT29-DR3 셀 DR3 antimitotic 에이전트에 의해 유도 된 apoptosis에 기여 하는 분자 메커니즘을 공부에 대 한 모델을 제공 합니다. 이 방식은 다양 하 고 반복 합니다. 절차의 성공, 프로토콜의 4 개의 중요 한 단계 해야 간주 합니다. 첫째, 높은 생성 하기 위하여 충분 한 바이러스 titer 그것 것이 좋습니다 같은 A 셀에 80%-90% 합류 때 D…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 (김소)에 53110000117 및 043222019 (X.W.)에 칭화 대학에서 교부 금에 의해 지원 되었다.
Materials
| DMEM | Invitrogen | C11965500BT | Supplemented with 10% FBS and 1% Penicilin/Streptomycin |
| Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7571 | |
| Paclitaxel | Selleck | S1150 | |
| pMXs-IRES-Blasicidin | Cell Biolabs | RTV-016 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| PBS | Invitrogen | C14190500BT | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Invitrogen | 25200056 | |
| 1,5-Dimethyl-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide | Santa Cruz | sc-134220 | |
| Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| Anti-mouse secondary antibody | |||
| anti-Flag antibody | Sigma | F-3165 | |
| HT29 cell line | ATCC | HTB-38 | |
| plat-A cell line | Cell Biolabs | RV-102 | |
| PVDF Immobilon-P | Millipore | IPVH00010 | |
| Cloning Cylinder | Sigma | C1059 | |
| Cell Imaging Multi-Mode Reader | Biotek | BTCYT3MV | |
| CKX53 Inverted Microscope | Olympus | CKX53 | |
| 12-well cell culture plates | Nest | 712001 | |
| 60 mm cell culture plates | Nest | 705001 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Nest | 601052 | |
| 0.22 μm steril filter | Millipore | SLGP033RB | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5810000327 | |
| 96 Well White Polystyrene Microplate | Corning | 3903 | |
| Western ECL Substrate | BIO-RAD | 1705060 | |
| ImageQuant LAS 4000 | GE Healthcare | ImageQuant LAS 4000 | |
| Decoloring Shaker | HINOTECH | TS-2000A | |
| Blasticidin | InvivoGen | ant-bl-1 | |
| Automated cell counter | BIO-RAD | TC 20 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985070 |
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