Oprettelse af cellelinjer overekspression DR3 for at vurdere den apoptotiske reaktion på anti-mitotiske Therapeutics
Summary
Etablering af en stabil cellelinie overekspression et gen af interesse at studere genfunktion kan gøres ved stabil Transfektion-picking enkelt kloner efter transfecting dem via retroviral infektion. Her viser vi, at HT29-DR3 cellelinjer genereres på denne måde belyse mekanismerne ved hvilken død receptor 3 (DR3) bidrager til antimitotics-induceret apoptose.
Abstract
At studere funktionen af et gen af interesse kan opnås ved at manipulere dens niveau for udtryk, såsom faldende dens udtryk med knockdown cellelinjer eller øge sit udtryk med overekspression cellelinjer. Forbigående og stabil Transfektion er to metoder, der bruges ofte til eksogene genekspression. Forbigående Transfektion er kun nyttig til at kortsigtede udtryk, mens stabil Transfektion tillader udefrakommende gener skal integreres i vært celle genom hvor det vil være løbende udtrykt. Som et resultat, er stabil Transfektion normalt ansat for forskning i langsigtede genetiske regulering. Her beskriver vi en enkel protokol for at generere en stabil cellelinie overekspression tagged død receptor 3 (DR3) at udforske DR3 funktion. Vi tog enkelt kloner efter en retroviral infektion for at opretholde ensartethed og renhed af de stabile cellelinjer. De stabile cellelinjer genereret ved hjælp af denne protokol render DR3-mangelfuld HT29 celler følsomme over for antimitotic stoffer, dermed erstatningsgodtgørelse apoptotiske svar i HT29 celler. Desuden, koden FLAG på DR3 kompenserer for utilgængelighed god DR3 antistof og letter biokemiske studier af den molekylære mekanisme som antimitotic agenter inducerer apoptose.
Introduction
Heterolog Gen-ekspression er ofte ansat til at studere funktionen af gener af interesse. To metoder, forbigående og stabil Transfektion, bruges mest i celler og molekylær biologi til at indsætte et segment af DNA eller RNA i en vært celle1,2. Forbigående transfekteret DNA eller RNA kan ikke blive videregivet til datterceller, så den genetiske ændring kan kun opbevares i en kort periode. På den anden side i stabilt transfekteret celler, er udefrakommende gener integreret i vært celle genom, fastholde sit udtryk i cellelinie. Stabil Transfektion er således en metode, der er normalt reserveret til forskning i langsigtede genetiske regulering. Den stabile cellelinie kan også transplanteres, som xenografts i musemodeller for in-vivo undersøgelse3. Stabil Transfektion kan opdeles i to kategorier: viral og nonviral. I forhold til nonviral Transfektion, kan virusinfektion overføre gener til en bredere vifte af menneskelige celler med en højere effektivitet4,5,6,7. Desuden tilbyder en stabil cellelinie fra en enkelt klon fordel af homogenitet og klonede renhed.
Ukontrolleret cellevækst og division er de mest karakteristiske træk ved kræft. I kliniske indstillinger er antimitotic agenter de primære behandlinger for mange typer af tumorer8. Imidlertid kan ikke nogle væsentlige begrænsninger af antimitotic agenter ignoreres. Først, disse kemoterapier kan også dræbe normale celler sammen med uønskede kræftceller, og således kan resultere i alvorlige bivirkninger8. Andet, antitubulin narkotika er ikke effektive mod alle typer af tumorer, trods tubulin’s allestedsnærværende udtryk i en bred vifte af forskellige væv som en cytoskeletal proteiner9,10. Det er uklart, hvorfor antitubulin agenter viste lovende effekt mod æggestokkene, lunge-, og hematological kræft i klinisk behandling, men ikke i nyrerne, tyktarmen eller pancreascancer11. Endelig, selv patienter med den samme type af tumor kan reagere på antimitotics anderledes på en uforudsigelig måde. Der kan være en afgørende effektor molekyle, der påvirker følsomheden af forskellige patienter til antimitotic agenter, hvilket resulterer i de forskellige resultater set i kliniske behandling12. Således, de potentielle differential følsomheder af patienter til antimitotic behandling bør tages i betragtning for at optimere terapeutiske indgreb13.
En høj overførselshastighed hele-genom siRNA Biblioteksskærmen demonstreret at DR3 knockdown kunne gøre følsomme celler resistente antimitotic medicin, implicere en rolle for DR3 i kemoterapi-induceret apoptose14. Som medlem af tumor nekrose faktor receptor (TNFR) superfamilien, er DR3 blevet rapporteret at mægle celle apoptose i forskellige systemer15,16,17,18. Således, vi satte sig for at etablere stabile cellelinjer overekspression DR3 for at studere de molekylære mekanismer, hvorved antimitotic narkotika inducerer apoptose. En passende celle model til at studere DR3 overekspression kan være fastsat af menneskelige colon cancer cellelinie HT29, der fandtes for at være DR3-mangelfuld. Derudover i klinikken, kolon kræft er ufølsom over for antimitotic narkotika19.
I denne artikel vil beskrive vi en metode, som giver mulighed for generation af en HT29-DR3 stabil cellelinie gennem retroviral infektion. Yderligere viser vi hvordan du validere DR3 udtryk i disse celler ved hjælp af western blotting og at vurdere følsomhed over for antimitotic agenter ved hjælp af en celle levedygtighed assay og morfologiske observation. Cellerne er amplificeret fra enkelt kloner, og således har fordel af en homogen genetiske baggrund. Desuden, tilladt koden FLAG på DR3 for visualisering af cellulære DR3 ved mikroskopi og analyse af gen expression og protein interaktion af biokemiske metoder. Cellerne kan endvidere være xenografted i mus til yderligere analysere tumor progression i svar til antimitotics i vivo14.
HT29-DR3 celle systemet præsenteres her tilbudt et effektivt redskab til at studere de molekylære mekanismer af hvordan antimitotics dræbe kræft celler14. Da overekspression og knockdown cellelinjer er fælles værktøjer til at studere genfunktion, kan denne protokol nemt tilpasses andre gener af interesse eller andre cellelinjer og, dermed, forvandlet til en udstrakt grad anvendte tilgang.
Protocol
Representative Results
Discussion
I dette manuskript beskriver vi en metode til at generere HT29-DR3 stabil cellelinjer. HT29-DR3 celler indeholder en model for at studere de molekylære mekanismer, hvorved DR3 bidrager til apoptose induceret af antimitotic agenter. Denne tilgang er alsidig og repeterbare. For at sikre succes i proceduren, skal fire vigtigste trin i protokollen overvejes. Først, for at producere en høj nok virus titer, det anbefales at udføre DNA Transfektion når Plat-A celler er på 80-90% confluence. Andet, viral suspensionen bør …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af tilskud 53110000117 (til GW) og 043222019 (til X.W.) fra Tsinghua University.
Materials
| DMEM | Invitrogen | C11965500BT | Supplemented with 10% FBS and 1% Penicilin/Streptomycin |
| Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7571 | |
| Paclitaxel | Selleck | S1150 | |
| pMXs-IRES-Blasicidin | Cell Biolabs | RTV-016 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| PBS | Invitrogen | C14190500BT | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Invitrogen | 25200056 | |
| 1,5-Dimethyl-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide | Santa Cruz | sc-134220 | |
| Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| Anti-mouse secondary antibody | |||
| anti-Flag antibody | Sigma | F-3165 | |
| HT29 cell line | ATCC | HTB-38 | |
| plat-A cell line | Cell Biolabs | RV-102 | |
| PVDF Immobilon-P | Millipore | IPVH00010 | |
| Cloning Cylinder | Sigma | C1059 | |
| Cell Imaging Multi-Mode Reader | Biotek | BTCYT3MV | |
| CKX53 Inverted Microscope | Olympus | CKX53 | |
| 12-well cell culture plates | Nest | 712001 | |
| 60 mm cell culture plates | Nest | 705001 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Nest | 601052 | |
| 0.22 μm steril filter | Millipore | SLGP033RB | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5810000327 | |
| 96 Well White Polystyrene Microplate | Corning | 3903 | |
| Western ECL Substrate | BIO-RAD | 1705060 | |
| ImageQuant LAS 4000 | GE Healthcare | ImageQuant LAS 4000 | |
| Decoloring Shaker | HINOTECH | TS-2000A | |
| Blasticidin | InvivoGen | ant-bl-1 | |
| Automated cell counter | BIO-RAD | TC 20 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985070 |
References
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Recillas-Targa, F. Multiple strategies for gene transfer, expression, knockdown, and chromatin influence in mammalian cell lines and transgenic animals. Molecular Biotechnology. 34 (3), 337-354 (2006).
- Daley, G. Q. Animal models of BCR/ABL-induced leukemias. Leukemia & Lymphoma. 11, 57-60 (1993).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. Sustained correction of X-linked severe combined immunodeficiency by ex vivo gene therapy. The New England. Journal of Medicine. 346 (16), 1185-1193 (2002).
- Roesler, J., et al. Third-generation, self-inactivating gp91(phox) lentivector corrects the oxidase defect in NOD/SCID mouse-repopulating peripheral blood-mobilized CD34+ cells from patients with X-linked chronic granulomatous disease. Blood. 100 (13), 4381-4390 (2002).
- Russell, W. C. Update on adenovirus and its vectors. Journal of General Virology. 81 (Pt 11), 2573-2604 (2000).
- Wasala, N. B., Shin, J. H., Duan, D. The evolution of heart gene delivery vectors. The Journal of Gene Medicine. 13 (10), 557-565 (2011).
- Zhou, J., Giannakakou, P. Targeting microtubules for cancer chemotherapy. Current Medicinal Chemistry – Anti-Cancer Agents. 5 (1), 65-71 (2005).
- Rovini, A., Savry, A., Braguer, D., Carre, M. Microtubule-targeted agents: when mitochondria become essential to chemotherapy. Biochimica et Biophysica Acta. 1807 (6), 679-688 (2011).
- Bhalla, K. N. Microtubule-targeted anticancer agents and apoptosis. Oncogene. 22 (56), 9075-9086 (2003).
- Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nature Reviews Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
- Bhat, K. M., Setaluri, V. Microtubule-associated proteins as targets in cancer chemotherapy. Clinical Cancer Research. 13 (10), 2849-2854 (2007).
- Bates, D., Eastman, A. Microtubule destabilising agents: far more than just antimitotic anticancer drugs. British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (2), 255-268 (2017).
- Qi, C., et al. Anti-mitotic chemotherapeutics promote apoptosis through TL1A-activated death receptor 3 in cancer cells. Cell Research. 28 (5), 544-555 (2018).
- Marsters, S. A., et al. Apo-3, a new member of the tumor necrosis factor receptor family, contains a death domain and activates apoptosis and NF-kappa B. Current Biology. 6 (12), 1669-1676 (1996).
- Chinnaiyan, A. M., et al. Signal transduction by DR3, a death domain-containing receptor related to TNFR-1 and CD95. Science. 274 (5289), 990-992 (1996).
- Xu, L. X., et al. Death receptor 3 mediates TNFSF15- and TNFalpha-induced endothelial cell apoptosis. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 55, 109-118 (2014).
- Wen, L., Zhuang, L., Luo, X., Wei, P. TL1A-induced NF-kappaB activation and c-IAP2 production prevent DR3-mediated apoptosis in TF-1 cells. Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 39251-39258 (2003).
- Nakayama, M., et al. Multiple pathways of TWEAK-induced cell death. Journal of Immunology. 168 (2), 734-743 (2002).
- Kitamura, T., et al. Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics. Experimental Hematology. 31 (11), 1007-1014 (2003).
- Wang, G., Shang, L., Burgett, A. W., Harran, P. G., Wang, X. Diazonamide toxins reveal an unexpected function for ornithine delta-amino transferase in mitotic cell division. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (7), 2068-2073 (2007).
- Hassan, M. S., von Holzen, U. Animal Model: Xenograft Mouse Models in Esophageal Adenocarcinoma. Methods in Molecular Biology. , 151-164 (2018).
- Potter, H., Heller, R. Transfection by electroporation. Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).
- Jacobsen, L., Calvin, S., Lobenhofer, E. Transcriptional effects of transfection: the potential for misinterpretation of gene expression data generated from transiently transfected cells. Biotechniques. 47 (1), 617-624 (2009).
- Hagen, L., Sharma, A., Aas, P. A., Slupphaug, G. Off-target responses in the HeLa proteome subsequent to transient plasmid-mediated transfection. Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (1), 84-90 (2015).
- Omidi, Y., et al. Microarray analysis of the toxicogenomics and the genotoxic potential of a cationic lipid-based gene delivery nanosystem in human alveolar epithelial a549 cells. Toxicology Mechanisms and Methods. 18 (4), 369-378 (2008).
