Établir des lignées de cellules surexprimant DR3 afin d’évaluer la réponse apoptotique thérapeutique anti mitotique
Summary
Établissant une lignée cellulaire stable surexprimant un gène d’intérêt d’étudier la fonction du gène peut être fait par stables clones unique de transfection-cueillette après les transfectants via une infection rétrovirale. Ici, nous montrons que les lignées de cellules HT29-DR3 générées de cette manière élucider les mécanismes par lequel la mort récepteur 3 (DR3) contribue à l’apoptose induite par antimitotiques.
Abstract
Étudier la fonction d’un gène d’intérêt est possible en manipulant son niveau d’expression, comme diminuant son expression avec des lignées cellulaires démontable ou augmentant son expression avec des lignées de cellules surexpression. Transfection stable et transitoire sont deux méthodes qui sont souvent utilisés pour l’expression des gènes exogènes. Transfection transitoire n’est utile pour l’expression à court terme, alors que transfection stable permet un gène exogène à intégrer dans le génome de la cellule hôte où il devra être exprimée en permanence. En conséquence, transfection stable est habituellement employée pour la recherche sur la régulation génétique à long terme. Nous décrivons ici un protocole simple pour générer une lignée cellulaire stable surexprimant le récepteur mort étiqueté 3 (DR3) à explorer la fonction DR3. Nous avons choisi des clones unique après une infection rétrovirale afin de maintenir l’homogénéité et la pureté des lignées cellulaires stables. Lignées cellulaires stables générées à l’aide de ce protocole rendent les cellules HT29 DR3-deficient sensibles aux drogues antimitotiques, reconstituant ainsi la réponse de l’apoptose dans les cellules HT29. En outre, l’étiquette d’indicateur sur DR3 compense l’absence de bons anticorps DR3 et facilite l’étude biochimique du mécanisme moléculaire par lequel les agents antimitotiques induisent l’apoptose.
Introduction
Expression de gène hétérologue est souvent employée pour étudier la fonction des gènes d’intérêt. Deux méthodes, transfection stable et transitoire, sont principalement utilisés dans les cellules et biologie moléculaire pour insérer un segment d’ADN ou d’ARN dans la cellule hôte1,2. Transfectées transitoirement l’ADN ou l’ARN ne peut être passé les cellules filles, donc la modification génétique seulement peut être conservée que pendant une courte période de temps. En revanche, dans les cellules transfectées de façon stable, gène exogène est intégrés dans le génome de cellule hôte, maintenir son expression dans la lignée cellulaire. Transfection stable est donc une méthode qui est habituellement réservée pour la recherche sur la régulation génétique à long terme. La lignée cellulaire stable peut également être transplantée xénogreffes dans des modèles murins pour in vivo étude3. Transfection stable peut être divisée en deux catégories : virales et nonviral. Par rapport à la transfection nonviral, infection virale peut transférer des gènes dans une plus grande variété de cellules humaines avec une efficacité plus élevée4,5,6,7. En outre, une lignée cellulaire stable d’un seul clone offre l’avantage de l’homogénéité et la pureté clonale.
Division et la croissance cellulaire incontrôlée sont les plus caractéristiques du cancer. En milieu clinique, agents antimitotiques sont les principaux traitements pour de nombreux types de tumeurs,8. Toutefois, certaines limitations importantes des agents antimitotiques ne peuvent être ignorées. Tout d’abord, ces chimiothérapies peuvent aussi tuer les cellules normales ainsi que les cellules cancéreuses indésirables et, par conséquent, peuvent entraîner des effets secondaires graves8. Deuxièmement, antitubulines médicaments ne sont pas efficaces contre tous les types de tumeurs, malgré l’expression omniprésente de tubuline dans une grande variété de différents tissus comme une protéine du cytosquelette9,10. On se demande pourquoi des agents antitubulines a montré une efficacité prometteuse contre ovaire, poumon et les cancers hématologiques traitement clinique, mais pas dans le rein, du côlon ou de cancers du pancréas11. Enfin, même les patients avec le même type de tumeur peuvent répondre aux antimitotiques différemment de manière imprévisible. Il peut y avoir d’une molécule effectrice clés qui affecte la sensibilité des différents patients aux agents antimitotiques, aboutissant à des résultats divers vus dans le traitement clinique12. Ainsi, la sensibilité différentielle potentielle des patients aux traitements antimitotiques devrait prendre en considération afin d’optimiser les interventions thérapeutiques13.
Un écran de bibliothèque haut débit du génome entier siARN ont démontré que DR3 knockdown pourrait rendre les cellules sensibles résistants aux médicaments antimitotiques, impliquant un rôle pour DR3 dans l’apoptose induite par la chimiothérapie,14. En tant que membre de la superfamille des récepteurs (TNFR) facteur de nécrose tumorale, DR3 a été signalé à la médiation de l’apoptose des cellules dans divers systèmes15,16,17,18. Ainsi, nous avons entrepris d’établir des lignées stables surexprimant DR3 afin d’étudier les mécanismes moléculaires par lesquels les drogues antimitotiques induisent l’apoptose. Un modèle de cellule approprié pour étudier la surexpression DR3 peut être fourni par la lignée de cellules cancéreuses du côlon humain HT29, qui s’est avéré déficient DR3. En outre, dans la clinique, les cancers du côlon sont insensibles à la drogue antimitotique19.
Dans cet article, nous décrivons une méthode qui permet la génération d’une lignée HT29-DR3 stable par infection rétrovirale. De plus, nous montrons comment valider l’expression DR3 dans ces cellules à l’aide de western blot et évaluer la sensibilité aux agents antimitotiques en utilisant une analyse de viabilité de cellules et l’observation morphologique. Les cellules sont amplifiés de simples clones et, ainsi, ont l’avantage d’un patrimoine génétique homogène. En outre, l’étiquette d’indicateur sur DR3 autorisés pour la visualisation de DR3 cellulaire par microscopie et analyse d’interaction de protéine et de l’expression de gène par des approches biochimiques. En outre, les cellules peuvent être initialement chez les souris pour poursuivre l’analyse en réponse aux antimitotiques in vivo14la progression tumorale.
Le système des cellules HT29-DR3 présenté ici offre un outil efficace pour étudier les mécanismes moléculaires de comment antimitotiques kill cancer cellules14. Étant donné que la surexpression et lignées cellulaires knockdown sont des outils communs pour l’étude de la fonction du gène, ce protocole peut être adapté facilement aux autres gènes d’intérêt ou d’autres lignées cellulaires et, ainsi, transformé en une approche largement utilisée.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce manuscrit, nous décrivons une méthode pour produire des lignées cellulaires stables HT29-DR3. Les cellules HT29-DR3 fournissent un modèle pour étudier les mécanismes moléculaires par lesquels DR3 contribue à l’apoptose induite par des agents antimitotiques. Cette approche est souple et répétable. Pour assurer le succès de la procédure, quatre étapes clés du protocole ont besoin à prendre en considération. Tout d’abord, afin de produire un haut assez titre de virus, il est recommandé d’effec…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les subventions 53110000117 (à G.W.) et 043222019 (à X.W.) de l’Université Tsinghua.
Materials
| DMEM | Invitrogen | C11965500BT | Supplemented with 10% FBS and 1% Penicilin/Streptomycin |
| Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7571 | |
| Paclitaxel | Selleck | S1150 | |
| pMXs-IRES-Blasicidin | Cell Biolabs | RTV-016 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| PBS | Invitrogen | C14190500BT | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Invitrogen | 25200056 | |
| 1,5-Dimethyl-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide | Santa Cruz | sc-134220 | |
| Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| Anti-mouse secondary antibody | |||
| anti-Flag antibody | Sigma | F-3165 | |
| HT29 cell line | ATCC | HTB-38 | |
| plat-A cell line | Cell Biolabs | RV-102 | |
| PVDF Immobilon-P | Millipore | IPVH00010 | |
| Cloning Cylinder | Sigma | C1059 | |
| Cell Imaging Multi-Mode Reader | Biotek | BTCYT3MV | |
| CKX53 Inverted Microscope | Olympus | CKX53 | |
| 12-well cell culture plates | Nest | 712001 | |
| 60 mm cell culture plates | Nest | 705001 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Nest | 601052 | |
| 0.22 μm steril filter | Millipore | SLGP033RB | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5810000327 | |
| 96 Well White Polystyrene Microplate | Corning | 3903 | |
| Western ECL Substrate | BIO-RAD | 1705060 | |
| ImageQuant LAS 4000 | GE Healthcare | ImageQuant LAS 4000 | |
| Decoloring Shaker | HINOTECH | TS-2000A | |
| Blasticidin | InvivoGen | ant-bl-1 | |
| Automated cell counter | BIO-RAD | TC 20 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985070 |
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