הקמת שורות תאים Overexpressing DR3 כדי להעריך את התגובה אפופטוטיים להיפגע הרפוי אנטי-mitotic
Summary
הקמת קו יציב תא overexpressing הגן עניין ללמוד פונקציה ג’ין יכול להיעשות על ידי שיבוטים יחיד יציב של חיטוט תרביות תאים לאחר transfecting אותם באמצעות retroviral זיהום. הנה אנחנו מראים כי HT29-DR3 שורות תאים שנוצרו בדרך זו להבהיר את מנגנוני מוות איזה קולטן 3 (DR3) תורמת antimitotics-induced אפופטוזיס.
Abstract
לומד את הפונקציה של הגן עניין יכולה להיות מושגת על-ידי מניפולציה לרמת הביטוי, כגון הפחתת הביטוי שלה עם שורות תאים תמונות ציפורים או להגדיל את הביטוי שלה עם שורות תאים ביטוי. תרביות תאים ארעית ויציבה הם שתי שיטות שבהן משמשים לעתים קרובות על ביטוי גנים אקסוגני. תרביות תאים ארעי שימושית רק ביטוי לטווח קצר, ואילו תקנים יציב מאפשר גנים אקסוגני לשלב את הגנום של התא המארח היכן זה ברציפות יתבטא. כתוצאה מכך, תרביות תאים יציב בדרך כלל מועסק למחקר לתוך תקנה גנטי לטווח ארוך. כאן נתאר פרוטוקול פשוט כדי ליצור קו יציב תא overexpressing מוות מתויג קולטן 3 (DR3) לחקור פונקציה DR3. בחרנו שיבוטים יחיד לאחר זיהום retroviral על מנת לשמור על הומוגניות של טוהר השורות תא יציב. הקווים תא יציב שנוצר באמצעות פרוטוקול זה לבלתי DR3 לקויה HT29 תאים רגישים לסמים antimitotic, ובכך לשחזר את התגובה אפופטוטיים להיפגע בתאים HT29. יתר על כן, התג דגל על DR3 מפצה על אי זמינות של נוגדן DR3 טוב ואסטמה ומקילה על המחקר הביוכימי של המנגנון המולקולרי שבאמצעותו סוכנים antimitotic לגרום אפופטוזיס.
Introduction
ביטוי גנים heterologous הוא מועסק בדרך כלל ללמוד את התפקוד של הגנים של עניין. שתי השיטות, תרביות תאים ארעית ויציבה, משמשים prevalently תאים וביולוגיה מולקולרית כדי להוסיף מקטע של DNA או RNA1,תא מארח2. ה-DNA או RNA transiently transfected שאי אפשר לעבור לתאי הבת, אז שינוי גנטי יכול להישמר רק לתקופה קצרה של זמן. מצד שני, stably transfected תאים, גנים אקסוגני משולבים לתוך הגנום התא המארח, סופגת ביטויה של הקו הסלולרי. לפיכך, תרביות תאים יציבה היא שיטה זה שמורה בדרך כלל למחקר לתוך תקנה גנטי לטווח ארוך. גם יכול להיות מושתלים הקו הסלולרי יציב כמו xenografts לתוך עכבר מודלים עבור ויוו ללמוד3. תרביות תאים יציבה ניתן לחלק לשתי קטגוריות: ויראלי, nonviral. לעומת תקנים nonviral, זיהום ויראלי יכול להעביר גנים לתוך מגוון רחב יותר של תאים אנושיים עם גבוה יותר יעילות4,5,6,7. יתר על כן, קו יציב תא שיבוט יחיד מציעה את היתרון של הומוגניות וטוהר המשובטים.
גידול תאים בלתי מבוקרת וחילוק הם בעלי התכונות להבחין ביותר של סרטן. הגדרות קליני, סוכנים antimitotic הם הטיפולים העיקרי עבור סוגים רבים של גידולים8. עם זאת, שאי אפשר להתעלם ממנו כמה מגבלות משמעותיות של סוכנים antimitotic. ראשית, אלה chemotherapies גם יכול להרוג תאים נורמליים יחד עם תאים סרטניים רצויה, לפיכך, יכול לגרום תופעות לוואי חמורות8. שנית, antitubulin סמים אינם יעילים נגד כל סוגי גידולים, למרות ביטוי בכל מקום של טובולין במגוון רחב של רקמות שונות כמו חלבון cytoskeletal9,10. לא ברור מדוע סוכנים antitubulin הראה מבטיח יעילות כנגד השחלות, ריאות, סרטן hematological בטיפול קליני, אך לא כליה, המעי הגס או סרטן הלבלב11. בסופו של דבר, אפילו חולים עם אותו סוג של גידול יכול להשיב antimitotics באופן שונה באופן בלתי צפוי. אולי יש מולקולה אפקטור המפתח המשפיעה על הרגישות של מטופלים שונים לסוכנים antimitotic, וכתוצאה מכך התוצאות מגוונות ראיתי טיפול רפואי12. לפיכך, פוטנציאל שהיא התכוונה דיפרנציאלית של חולים לטיפול antimitotic צריך לקחת בחשבון כדי לייעל התערבויות טיפוליות13.
מסך ספריית תפוקה גבוהה הגנום כולו siRNA הפגינו DR3 נוקאאוט לחסרת רגישות תאים עמידים בפני תרופות antimitotic, שמערבות תפקיד עבור DR3 אפופטוזיס כימותרפיה14. כחבר superfamily קולטן (TNFR) הגידול נקרוזה מקדם, דווח DR3 לתווך תא אפופטוזיס שונים מערכות15,16,17,18. לפיכך, יצאנו להקים שורות תאים יציב overexpressing DR3 ללמוד המנגנון המולקולרי שבאמצעותו סמים antimitotic לגרום אפופטוזיס. מודל תאים מתאים עבור הלומדים DR3 ביטוי יכולה להינתן על ידי הקו התא סרטן המעי הגס האנושי HT29, אשר נמצאה להיות DR3 לקויה. בנוסף, במרפאה, סרטן המעי הגס הם רגישות antimitotic סמים19.
במאמר זה, אנו מתארים שיטה המאפשרת את הדור של קו יציב תא HT29-DR3 דרך retroviral זיהום. בהמשך נראה כיצד לאמת את הביטוי DR3 בתאים אלה באמצעות סופג המערבי וכיצד להעריך את הרגישות לסוכנים antimitotic על-ידי שימוש assay הכדאיות תא והתבוננות מורפולוגי. התאים הם מוגבר מן שיבוטים יחיד, ולכן, יש את היתרון של רקע גנטי הומוגני. בנוסף, דגל תג על DR3 מותר עבור הפריט החזותי של DR3 התאית על ידי מיקרוסקופ וניתוח של ג’ין ביטוי וחלבון אינטראקציה על ידי גישות הביוכימי. יתר על כן, התאים ניתן xenografted בעכברים לנתח יותר התקדמות הגידול בתגובה antimitotics ויוו14.
תא HT29-DR3 המערכת המוצגת כאן מוצעים כלי יעיל עבור הלומדים את המנגנונים המולקולריים של מה antimitotics להרוג את תאי הסרטן14. מאז ביטוי וקווים תא תמונות ציפורים הם כלים נפוצים ללמוד תפקוד הגן, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם בקלות גנים אחרים מעניינים או שורות תאים אחרים והפכו, לפיכך, גישה בשימוש נרחב.
Protocol
Representative Results
Discussion
כתב יד זה, אנו מתארים שיטה ליצירת שורות תאים יציב HT29-DR3. תאים HT29-DR3 מספקות מודל לימוד המנגנון המולקולרי שבאמצעותו DR3 תורמת אפופטוזיס המושרה על ידי סוכנים antimitotic. גישה זו היא תכליתי הדיר. כדי להבטיח ההצלחה של ההליך, ארבעה שלבים מרכזיים של הפרוטוקול צריך להיחשב. ראשית, על מנת לייצר גבוה מספיק כי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים 53110000117 (כדי G.W.) ו 043222019 (ל X.W.) מאוניברסיטת צינג.
Materials
| DMEM | Invitrogen | C11965500BT | Supplemented with 10% FBS and 1% Penicilin/Streptomycin |
| Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7571 | |
| Paclitaxel | Selleck | S1150 | |
| pMXs-IRES-Blasicidin | Cell Biolabs | RTV-016 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| PBS | Invitrogen | C14190500BT | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Invitrogen | 25200056 | |
| 1,5-Dimethyl-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide | Santa Cruz | sc-134220 | |
| Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| Anti-mouse secondary antibody | |||
| anti-Flag antibody | Sigma | F-3165 | |
| HT29 cell line | ATCC | HTB-38 | |
| plat-A cell line | Cell Biolabs | RV-102 | |
| PVDF Immobilon-P | Millipore | IPVH00010 | |
| Cloning Cylinder | Sigma | C1059 | |
| Cell Imaging Multi-Mode Reader | Biotek | BTCYT3MV | |
| CKX53 Inverted Microscope | Olympus | CKX53 | |
| 12-well cell culture plates | Nest | 712001 | |
| 60 mm cell culture plates | Nest | 705001 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Nest | 601052 | |
| 0.22 μm steril filter | Millipore | SLGP033RB | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5810000327 | |
| 96 Well White Polystyrene Microplate | Corning | 3903 | |
| Western ECL Substrate | BIO-RAD | 1705060 | |
| ImageQuant LAS 4000 | GE Healthcare | ImageQuant LAS 4000 | |
| Decoloring Shaker | HINOTECH | TS-2000A | |
| Blasticidin | InvivoGen | ant-bl-1 | |
| Automated cell counter | BIO-RAD | TC 20 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985070 |
References
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Recillas-Targa, F. Multiple strategies for gene transfer, expression, knockdown, and chromatin influence in mammalian cell lines and transgenic animals. Molecular Biotechnology. 34 (3), 337-354 (2006).
- Daley, G. Q. Animal models of BCR/ABL-induced leukemias. Leukemia & Lymphoma. 11, 57-60 (1993).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. Sustained correction of X-linked severe combined immunodeficiency by ex vivo gene therapy. The New England. Journal of Medicine. 346 (16), 1185-1193 (2002).
- Roesler, J., et al. Third-generation, self-inactivating gp91(phox) lentivector corrects the oxidase defect in NOD/SCID mouse-repopulating peripheral blood-mobilized CD34+ cells from patients with X-linked chronic granulomatous disease. Blood. 100 (13), 4381-4390 (2002).
- Russell, W. C. Update on adenovirus and its vectors. Journal of General Virology. 81 (Pt 11), 2573-2604 (2000).
- Wasala, N. B., Shin, J. H., Duan, D. The evolution of heart gene delivery vectors. The Journal of Gene Medicine. 13 (10), 557-565 (2011).
- Zhou, J., Giannakakou, P. Targeting microtubules for cancer chemotherapy. Current Medicinal Chemistry – Anti-Cancer Agents. 5 (1), 65-71 (2005).
- Rovini, A., Savry, A., Braguer, D., Carre, M. Microtubule-targeted agents: when mitochondria become essential to chemotherapy. Biochimica et Biophysica Acta. 1807 (6), 679-688 (2011).
- Bhalla, K. N. Microtubule-targeted anticancer agents and apoptosis. Oncogene. 22 (56), 9075-9086 (2003).
- Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nature Reviews Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
- Bhat, K. M., Setaluri, V. Microtubule-associated proteins as targets in cancer chemotherapy. Clinical Cancer Research. 13 (10), 2849-2854 (2007).
- Bates, D., Eastman, A. Microtubule destabilising agents: far more than just antimitotic anticancer drugs. British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (2), 255-268 (2017).
- Qi, C., et al. Anti-mitotic chemotherapeutics promote apoptosis through TL1A-activated death receptor 3 in cancer cells. Cell Research. 28 (5), 544-555 (2018).
- Marsters, S. A., et al. Apo-3, a new member of the tumor necrosis factor receptor family, contains a death domain and activates apoptosis and NF-kappa B. Current Biology. 6 (12), 1669-1676 (1996).
- Chinnaiyan, A. M., et al. Signal transduction by DR3, a death domain-containing receptor related to TNFR-1 and CD95. Science. 274 (5289), 990-992 (1996).
- Xu, L. X., et al. Death receptor 3 mediates TNFSF15- and TNFalpha-induced endothelial cell apoptosis. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 55, 109-118 (2014).
- Wen, L., Zhuang, L., Luo, X., Wei, P. TL1A-induced NF-kappaB activation and c-IAP2 production prevent DR3-mediated apoptosis in TF-1 cells. Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 39251-39258 (2003).
- Nakayama, M., et al. Multiple pathways of TWEAK-induced cell death. Journal of Immunology. 168 (2), 734-743 (2002).
- Kitamura, T., et al. Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics. Experimental Hematology. 31 (11), 1007-1014 (2003).
- Wang, G., Shang, L., Burgett, A. W., Harran, P. G., Wang, X. Diazonamide toxins reveal an unexpected function for ornithine delta-amino transferase in mitotic cell division. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (7), 2068-2073 (2007).
- Hassan, M. S., von Holzen, U. Animal Model: Xenograft Mouse Models in Esophageal Adenocarcinoma. Methods in Molecular Biology. , 151-164 (2018).
- Potter, H., Heller, R. Transfection by electroporation. Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).
- Jacobsen, L., Calvin, S., Lobenhofer, E. Transcriptional effects of transfection: the potential for misinterpretation of gene expression data generated from transiently transfected cells. Biotechniques. 47 (1), 617-624 (2009).
- Hagen, L., Sharma, A., Aas, P. A., Slupphaug, G. Off-target responses in the HeLa proteome subsequent to transient plasmid-mediated transfection. Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (1), 84-90 (2015).
- Omidi, Y., et al. Microarray analysis of the toxicogenomics and the genotoxic potential of a cationic lipid-based gene delivery nanosystem in human alveolar epithelial a549 cells. Toxicology Mechanisms and Methods. 18 (4), 369-378 (2008).
