Stabilire linee di cellule che Overexpressing DR3 per valutare la risposta apoptotica di anti-mitotico Therapeutics
Summary
Stabilire una linea di cellulari stabili che overexpressing un gene di interesse per lo studio di funzione del gene può essere fatto da stabili transfezione-picking singoli cloni dopo trasfezione loro tramite infezione retrovirale. Qui indichiamo che linee di cellule HT29-DR3 generate in questo modo delucidare i meccanismi da cui la morte recettore 3 (DR3) contribuisce all’apoptosi indotta da antimitotici.
Abstract
Studiare la funzione di un gene di interesse può essere realizzato manipolando il suo livello di espressione, ad esempio diminuendo sua espressione con linee cellulari atterramento o aumentando la sua espressione con sovraespressione di cellula. Trasfezione transiente e stabile sono due metodi che vengono spesso utilizzati per l’espressione genica esogeno. Trasfezione transiente è utile solo per espressione a breve termine, mentre transfezione stabile consente di geni esogeni essere integrato nel genoma della cellula ospite dove sarà continuamente espresso. Di conseguenza, la transfezione stabile è solitamente utilizzata per la ricerca nella regolazione genica a lungo termine. Qui descriviamo un protocollo semplice per generare una linea stabile delle cellule che overexpressing taggati death receptor 3 (DR3) per esplorare DR3 funzione. Abbiamo scelto singoli cloni dopo un’infezione retrovirale per mantenere l’omogeneità e la purezza delle linee cellulari stabili. Le linee cellulari stabili generate utilizzando questo protocollo rendono le cellule HT29 DR3-carenti sensibile ai farmaci antimitotici, ricostituendo così la risposta apoptotica in cellule HT29. Inoltre, il tag di bandiera il DR3 compensa l’indisponibilità di buona DR3 anticorpo e facilita lo studio biochimico del meccanismo molecolare attraverso il quale gli agenti antimitotici inducono apoptosi.
Introduction
Espressione del gene eterologo è spesso impiegato per studiare la funzione dei geni di interesse. Due metodi, trasfezione transiente e stabile, sono impiegati prevalentemente nelle cellule e biologia molecolare per inserire un segmento di DNA o RNA in un host cella1,2. Transitoriamente transfected DNA o RNA può essere trasmessa alle cellule figlie, quindi l’alterazione genetica possa essere conservato solo per un breve periodo di tempo. D’altra parte, in modo stabile transfected le cellule, geni esogeni sono integrati nel genoma della cellula ospite, sostenere la sua espressione nella linea cellulare. Così, la transfezione stabile è un metodo che è solitamente riservato per la ricerca sulla regolazione genica a lungo termine. La linea cellulare stabile possa essere trapiantata anche come xenotrapianti in modelli murini per in vivo studiano3. Transfezione stabile può essere diviso in due categorie: virale e nonviral. Rispetto alla transfezione nonviral, infezione virale può trasferire geni in una più ampia varietà di cellule umane con una più alta efficienza4,5,6,7. Inoltre, una linea cellulare stabile da un singolo clone offre il vantaggio di omogeneità e purezza clonale.
Divisione e crescita incontrollata delle cellule sono le caratteristiche più distintive di cancro. Nelle regolazioni cliniche, agenti antimitotici sono trattamenti primari per molti tipi di tumori8. Tuttavia, alcune limitazioni significative degli agenti antimitotici non possono essere ignorati. In primo luogo, questi chemioterapie possono anche uccidere le cellule normali insieme con le cellule cancerose indesiderate e, quindi, possono provocare gravi effetti collaterali8. In secondo luogo, antitubulin farmaci non sono efficaci contro tutti i tipi di tumori, nonostante il espressione ubiquitaria di tubulina in un’ampia varietà di tessuti diversi come una proteina del citoscheletro9,10. Non è chiaro perché antitubulin agenti hanno mostrato promettente efficacia contro ovarico, polmone e cancri ematologici nel trattamento clinico, ma non nel rene, colon o tumori pancreatici11. Infine, anche i pazienti con lo stesso tipo di tumore possono rispondere gli antimitotici diversamente in modo imprevedibile. Ci può essere una molecola effettore chiave che colpisce la sensibilità di diversi pazienti agli agenti antimitotici, conseguente i diversi risultati visti nel trattamento clinico12. Così, la potenziale sensibilità differenziale dei pazienti al trattamento antimitotiche dovrebbe tener conto al fine di ottimizzare gli interventi terapeutici13.
Una schermata di biblioteca di alto-rendimento intero genoma siRNA ha dimostrato che DR3 atterramento potrebbe rendere sensibili cellule resistenti ai farmaci antimitotici, implicando un ruolo nell’apoptosi indotta da chemioterapia14DR3. Come un membro della superfamiglia del recettore (TNFR) di fattore di necrosi tumorale, DR3 è stato segnalato per mediare apoptosi delle cellule in vari sistemi15,16,17,18. Così, abbiamo deciso di stabilire linee cellulari stabili che overexpressing DR3 per studiare i meccanismi molecolari da cui farmaci antimitotici inducono apoptosi. Un modello di cella appropriata per studiare DR3 sovraespressione può essere fornito dalla linea cellulare di cancro umano del colon HT29, che è stato trovato per essere DR3-carenti. Inoltre, nella clinica, tumori del colon sono insensibili ai farmaci antimitotico19.
In questo articolo, descriviamo un metodo che consente la generazione di una linea cellulare stabile HT29-DR3 attraverso infezione retrovirale. Più ulteriormente indichiamo come convalidare l’espressione DR3 in queste cellule mediante western blotting e come valutare la sensibilità agli agenti antimitotici utilizzando un’analisi di attuabilità delle cellule e l’osservazione morfologica. Le cellule sono amplificate da singoli cloni e, pertanto, hanno il vantaggio di un background genetico omogeneo. Inoltre, il tag di bandiera il DR3 ammessi per la visualizzazione dei cellulari DR3 da microscopia e analisi di interazione della proteina e di espressione genica mediante approcci biochimici. Inoltre, le cellule possono essere xenotrapiantate nei topi per analizzare ulteriormente la progressione del tumore in risposta a antimitotici in vivo14.
Il sistema di cellule HT29-DR3 presentato qui offerto uno strumento efficace per lo studio dei meccanismi molecolari di come antimitotici kill cancro cellule14. Poiché la sovraespressione e atterramento di cellula è strumenti comuni per lo studio della funzione del gene, questo protocollo può essere adattato facilmente ad altri geni di interesse o di altre linee cellulari e, quindi, trasformato in un approccio ampiamente utilizzato.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo manoscritto, descriviamo un metodo per generare linee cellulari stabili HT29-DR3. Le cellule HT29-DR3 forniscono un modello per studiare i meccanismi molecolari da cui DR3 contribuisce all’apoptosi indotta da agenti antimitotici. Questo approccio è versatile e ripetibile. Per garantire il successo della procedura, è necessario considerare quattro passaggi chiave del protocollo. In primo luogo, al fine di produrre un alto abbastanza titolo del virus, si consiglia di eseguire la transfezione del DNA quando le c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni 53110000117 (di G.W.) e 043222019 (per X.W.) presso la Tsinghua University.
Materials
| DMEM | Invitrogen | C11965500BT | Supplemented with 10% FBS and 1% Penicilin/Streptomycin |
| Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7571 | |
| Paclitaxel | Selleck | S1150 | |
| pMXs-IRES-Blasicidin | Cell Biolabs | RTV-016 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| PBS | Invitrogen | C14190500BT | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Invitrogen | 25200056 | |
| 1,5-Dimethyl-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide | Santa Cruz | sc-134220 | |
| Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| Anti-mouse secondary antibody | |||
| anti-Flag antibody | Sigma | F-3165 | |
| HT29 cell line | ATCC | HTB-38 | |
| plat-A cell line | Cell Biolabs | RV-102 | |
| PVDF Immobilon-P | Millipore | IPVH00010 | |
| Cloning Cylinder | Sigma | C1059 | |
| Cell Imaging Multi-Mode Reader | Biotek | BTCYT3MV | |
| CKX53 Inverted Microscope | Olympus | CKX53 | |
| 12-well cell culture plates | Nest | 712001 | |
| 60 mm cell culture plates | Nest | 705001 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Nest | 601052 | |
| 0.22 μm steril filter | Millipore | SLGP033RB | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5810000327 | |
| 96 Well White Polystyrene Microplate | Corning | 3903 | |
| Western ECL Substrate | BIO-RAD | 1705060 | |
| ImageQuant LAS 4000 | GE Healthcare | ImageQuant LAS 4000 | |
| Decoloring Shaker | HINOTECH | TS-2000A | |
| Blasticidin | InvivoGen | ant-bl-1 | |
| Automated cell counter | BIO-RAD | TC 20 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985070 |
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