Att upprätta cellinjer överuttryck DR3 för att bedöma den apoptotiska svar på anti mitotiska Therapeutics
Summary
Om upprättande av en stabil cellinje överuttryck av en gen av intresse att studera geners funktion kan göras genom stabila transfection-plockning enstaka kloner efter transfecting dem via retrovirala infektion. Här visar vi att HT29-DR3 cellinjer som genereras på detta sätt belysa de mekanismer genom vilka död receptor 3 (DR3) bidrar till antimitotics-inducerad apoptos.
Abstract
Studera funktionen av en gen av intresse kan uppnås genom att manipulera sin nivå till uttryck, såsom minska sitt uttryck med knockdown cellinjer eller öka sitt uttryck med överuttryck cellinjer. Övergående och stabil transfection är två metoder som ofta används för exogena genuttryck. Övergående transfection är endast användbar för kortsiktiga uttryck, medan stabil transfection tillåter exogena gener ska integreras i den mottagande cell arvsmassan där det kontinuerligt kommer att uttryckas. Därför används vanligen stabil transfection för forskning i långsiktiga genetiska regleringen. Här beskriver vi ett enkelt protokoll för att generera en stabil cellinje överuttryck märkta död receptor 3 (DR3) att utforska DR3 funktion. Vi plockade enda kloner efter en retrovirala infektion för att upprätthålla den homogenitet och renhet av stabil cellinjer. De stabila cellinjer som genereras med hjälp av detta protokoll återges DR3-brist HT29 celler känsliga för Mitoshämmande läkemedel, således beredning apoptotiska svaret i HT29 celler. Dessutom flagga etiketten på DR3 kompenserar för avsaknaden av bra DR3 antikropp och underlättar biokemiska studier av den molekylära mekanismen genom vilken Mitoshämmande agenter inducera apoptos.
Introduction
Heterologa genuttryck är ofta anställd att studera funktionen hos gener av intresse. Två metoder, övergående och stabil transfection, används huvudsakligen i celler och molekylärbiologi för att infoga ett segment av DNA eller RNA i en mottagande cell1,2. Övergående transfekterade DNA eller RNA kan inte överföras till dotterceller, så den genetiska förändringen kan endast bevaras under en kort tid. Däremot, i stabilt transfekterade celler, är exogena gener integrerade i mottagande cell genomet, upprätthålla sitt uttryck i cellinje. Stabil transfection är alltså en metod som är vanligtvis reserverad för forskning om långsiktiga genetiska regleringen. Den stabila cellinje kan också transplanteras som xenograft i musmodeller för in vivo studie3. Stabil transfection kan delas in i två kategorier: virus- och nonviral. Jämfört med nonviral transfection, kan virusinfektion överföra gener till ett bredare utbud av mänskliga celler med en högre effektivitet4,5,6,7. Dessutom erbjuder en stabil cellinje från en enda klon fördelen av homogenitet och klonal renhet.
Okontrollerad celltillväxt och delning är de mest utmärkande dragen av cancer. I kliniska inställningar är Mitoshämmande agenter de primära behandlingarna för många typer av tumörer8. Dock kan inte vissa betydande begränsningar av Mitoshämmande agenter ignoreras. Första dessa kemoterapier kan också döda normala celler tillsammans med oönskad cancerceller, och således kan resultera i allvarliga biverkningar8. Andra, antitubulin läkemedel är inte effektiva mot alla typer av tumörer, trots tubulin’s allestädes närvarande uttryck i en mängd olika vävnader som ett cytoskeletal protein9,10. Det är oklart varför antitubulin agenter visade lovande effekt mot äggstockscancer, lungcancer och hematologiska cancerformer i klinisk behandling, men inte i njure, kolon eller pankreas cancer11. Slutligen kan även patienter med samma typ av tumör svarar att antimitotics olika på ett oförutsägbart sätt. Det kan finnas en nyckel effektor-molekyl som påverkar känsligheten hos olika patienter till Mitoshämmande ombud, vilket resulterar i varierande resultaten ses i klinisk behandling12. Således, de potentiella differentiell känslighet av patienter till Mitoshämmande behandling bör beaktas för att optimera terapeutiska interventioner13.
En hög genomströmning helgenom-siRNA bibliotek skärm visade att DR3 knockdown kunde återge ljuskänsliga celler resistenta mot Mitoshämmande läkemedel, ifrågasätta en roll för DR3 i kemoterapi-inducerad apoptos14. Som medlem av tumörnekrosfaktor receptor (TNFR) superfamiljen har DR3 rapporterats att medla cell apoptos i olika system15,16,17,18. Således anges vi för att upprätta stabila cellinjer överuttryck DR3 för att studera molekylära mekanismer genom vilka Mitoshämmande läkemedel inducerar apoptos. En cell lämplig modell för att studera DR3 överuttryck kan tillhandahållas av den mänskliga kolon cancer cell linjen HT29, som befanns vara DR3-brist. Dessutom i kliniken, kolon cancer är okänsliga för Mitoshämmande läkemedel19.
I den här artikeln beskriver vi en metod som möjliggör generering av en HT29-DR3 stabil cellinje genom retrovirala infektion. Vidare visar vi hur du validera DR3 uttrycket i dessa celler med western blotting och att bedöma känsligheten för Mitoshämmande agenter med hjälp av en cell lönsamhet analysen och morfologiska observation. Celler förökas från enda kloner och därmed har fördelen av en homogen genetiska bakgrund. Dessutom tillåts taggen flagga på DR3 för visualisering av cellulära DR3 av mikroskopi och analys av gen uttryck och protein interaktion genom biokemiska metoder. Cellerna kan dessutom vara xenografted hos möss att ytterligare analysera tumör progression som svar på antimitotics i vivo14.
HT29-DR3 cellen systemet presenteras här erbjöd ett effektivt verktyg för att studera molekylära mekanismer för hur antimitotics döda cancer celler14. Eftersom överuttryck och knockdown cellinjer är gemensamma verktyg för att studera geners funktion, kan detta protokoll enkelt anpassas efter andra gener av intresse eller andra cellinjer och, således, förvandlas till ett flitigt använt tillvägagångssätt.
Protocol
Representative Results
Discussion
I detta manuskript beskriver vi en metod för att generera HT29-DR3 stabil cellinjer. HT29-DR3 celler ger en modell för att studera molekylära mekanismer genom vilka DR3 bidrar till apoptos induceras av Mitoshämmande agenter. Detta synsätt är mångsidig och repeterbar. För att säkerställa framgången för förfarandet, behöver fyra viktiga steg i protokollet beaktas. Först, för att producera en hög nog virus titer, det rekommenderas att utföra DNA transfection när Plat-A cellerna är på 80-90% confluence. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av bidrag 53110000117 (att G.W.) och 043222019 (till WX) från Tsinghua University.
Materials
| DMEM | Invitrogen | C11965500BT | Supplemented with 10% FBS and 1% Penicilin/Streptomycin |
| Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7571 | |
| Paclitaxel | Selleck | S1150 | |
| pMXs-IRES-Blasicidin | Cell Biolabs | RTV-016 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| PBS | Invitrogen | C14190500BT | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Invitrogen | 25200056 | |
| 1,5-Dimethyl-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide | Santa Cruz | sc-134220 | |
| Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| Anti-mouse secondary antibody | |||
| anti-Flag antibody | Sigma | F-3165 | |
| HT29 cell line | ATCC | HTB-38 | |
| plat-A cell line | Cell Biolabs | RV-102 | |
| PVDF Immobilon-P | Millipore | IPVH00010 | |
| Cloning Cylinder | Sigma | C1059 | |
| Cell Imaging Multi-Mode Reader | Biotek | BTCYT3MV | |
| CKX53 Inverted Microscope | Olympus | CKX53 | |
| 12-well cell culture plates | Nest | 712001 | |
| 60 mm cell culture plates | Nest | 705001 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Nest | 601052 | |
| 0.22 μm steril filter | Millipore | SLGP033RB | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5810000327 | |
| 96 Well White Polystyrene Microplate | Corning | 3903 | |
| Western ECL Substrate | BIO-RAD | 1705060 | |
| ImageQuant LAS 4000 | GE Healthcare | ImageQuant LAS 4000 | |
| Decoloring Shaker | HINOTECH | TS-2000A | |
| Blasticidin | InvivoGen | ant-bl-1 | |
| Automated cell counter | BIO-RAD | TC 20 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985070 |
References
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Recillas-Targa, F. Multiple strategies for gene transfer, expression, knockdown, and chromatin influence in mammalian cell lines and transgenic animals. Molecular Biotechnology. 34 (3), 337-354 (2006).
- Daley, G. Q. Animal models of BCR/ABL-induced leukemias. Leukemia & Lymphoma. 11, 57-60 (1993).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. Sustained correction of X-linked severe combined immunodeficiency by ex vivo gene therapy. The New England. Journal of Medicine. 346 (16), 1185-1193 (2002).
- Roesler, J., et al. Third-generation, self-inactivating gp91(phox) lentivector corrects the oxidase defect in NOD/SCID mouse-repopulating peripheral blood-mobilized CD34+ cells from patients with X-linked chronic granulomatous disease. Blood. 100 (13), 4381-4390 (2002).
- Russell, W. C. Update on adenovirus and its vectors. Journal of General Virology. 81 (Pt 11), 2573-2604 (2000).
- Wasala, N. B., Shin, J. H., Duan, D. The evolution of heart gene delivery vectors. The Journal of Gene Medicine. 13 (10), 557-565 (2011).
- Zhou, J., Giannakakou, P. Targeting microtubules for cancer chemotherapy. Current Medicinal Chemistry – Anti-Cancer Agents. 5 (1), 65-71 (2005).
- Rovini, A., Savry, A., Braguer, D., Carre, M. Microtubule-targeted agents: when mitochondria become essential to chemotherapy. Biochimica et Biophysica Acta. 1807 (6), 679-688 (2011).
- Bhalla, K. N. Microtubule-targeted anticancer agents and apoptosis. Oncogene. 22 (56), 9075-9086 (2003).
- Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nature Reviews Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
- Bhat, K. M., Setaluri, V. Microtubule-associated proteins as targets in cancer chemotherapy. Clinical Cancer Research. 13 (10), 2849-2854 (2007).
- Bates, D., Eastman, A. Microtubule destabilising agents: far more than just antimitotic anticancer drugs. British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (2), 255-268 (2017).
- Qi, C., et al. Anti-mitotic chemotherapeutics promote apoptosis through TL1A-activated death receptor 3 in cancer cells. Cell Research. 28 (5), 544-555 (2018).
- Marsters, S. A., et al. Apo-3, a new member of the tumor necrosis factor receptor family, contains a death domain and activates apoptosis and NF-kappa B. Current Biology. 6 (12), 1669-1676 (1996).
- Chinnaiyan, A. M., et al. Signal transduction by DR3, a death domain-containing receptor related to TNFR-1 and CD95. Science. 274 (5289), 990-992 (1996).
- Xu, L. X., et al. Death receptor 3 mediates TNFSF15- and TNFalpha-induced endothelial cell apoptosis. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 55, 109-118 (2014).
- Wen, L., Zhuang, L., Luo, X., Wei, P. TL1A-induced NF-kappaB activation and c-IAP2 production prevent DR3-mediated apoptosis in TF-1 cells. Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 39251-39258 (2003).
- Nakayama, M., et al. Multiple pathways of TWEAK-induced cell death. Journal of Immunology. 168 (2), 734-743 (2002).
- Kitamura, T., et al. Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics. Experimental Hematology. 31 (11), 1007-1014 (2003).
- Wang, G., Shang, L., Burgett, A. W., Harran, P. G., Wang, X. Diazonamide toxins reveal an unexpected function for ornithine delta-amino transferase in mitotic cell division. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (7), 2068-2073 (2007).
- Hassan, M. S., von Holzen, U. Animal Model: Xenograft Mouse Models in Esophageal Adenocarcinoma. Methods in Molecular Biology. , 151-164 (2018).
- Potter, H., Heller, R. Transfection by electroporation. Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).
- Jacobsen, L., Calvin, S., Lobenhofer, E. Transcriptional effects of transfection: the potential for misinterpretation of gene expression data generated from transiently transfected cells. Biotechniques. 47 (1), 617-624 (2009).
- Hagen, L., Sharma, A., Aas, P. A., Slupphaug, G. Off-target responses in the HeLa proteome subsequent to transient plasmid-mediated transfection. Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (1), 84-90 (2015).
- Omidi, Y., et al. Microarray analysis of the toxicogenomics and the genotoxic potential of a cationic lipid-based gene delivery nanosystem in human alveolar epithelial a549 cells. Toxicology Mechanisms and Methods. 18 (4), 369-378 (2008).
