Anti-mitotik Therapeutics apoptotik yanıtı değerlendirmek için DR3 Overexpressing hücre satırları oluşturma
Summary
Bir gen gen işlev eğitim ilgi overexpressing bir istikrarlı hücre kültürünü kuran istikrarlı transfection-toplama tek klonlar tarafından via retroviral enfeksiyon transfecting sonra yapılabilir. İşte bu şekilde oluşturulan HT29-DR3 hücre hatları tarafından hangi ölüm reseptör 3 (DR3) antimitotics kaynaklı apoptosis katkıda mekanizmaları aydınlatmak göstermektedir.
Abstract
Işlev bir genin ilgi eğitim seviyesine ifadenin, ifadesini devirme hücre hatları ile azalan veya artan ifadesini overexpression hücre hatları ile gibi manipüle ederek elde edilebilir. Geçici ve istikrarlı transfection eksojen gen ekspresyonu için sık sık kullanılan iki yöntem vardır. İse nerede sürekli olarak belirtilecektir konak hücre genomu entegre olmak eksojen genler istikrarlı transfection sağlar geçici transfection sadece kısa vadeli ifade için yararlıdır. Sonuç olarak, istikrarlı transfection genellikle araştırma için uzun vadeli genetik düzenleme istihdam edilmektedir. Burada etiketli ölüm reseptör 3 (DR3 DR3 işlevi keşfetmek için) overexpressing bir istikrarlı hücre satırı oluşturmak için basit bir protokol açıklayın. Tek klonlar retroviral bir enfeksiyondan sonra homojenliği ve istikrarlı hücre hatları saflığı korumak için aldık. Bu iletişim kuralı kullanılarak oluşturulan istikrarlı hücre hatları DR3-eksik HT29 hücreleri hassas antimitotic ilaçlara, böylece HT29 hücreleri apoptotik yanıtta başlamaktan render. Ayrıca, DR3 bayrak etiketinde iyi DR3 antikor kullanılamamasıdır için dengeler ve hangi tarafından apoptosis antimitotic ajanlar neden moleküler mekanizması biyokimyasal çalışma kolaylaştırır.
Introduction
Kapaklı gen ekspresyonu kez ilgi genlerin fonksiyonun çalışmaya istihdam edilmektedir. İki yöntem, geçici ve istikrarlı transfection, hücre ve moleküler biyoloji DNA veya RNA bir parçasını bir konak hücre1,2eklemek için yüksekokul kullanılır. Genetik değişiklik yalnızca kısa bir süre için muhafaza edilebilir böylece geçici transfected DNA veya RNA kızı hücrelere geçirilemez. Öte yandan, stabil transfected hücrelerde eksojen genler ifadesini hücre içinde sürdürülmesi konak hücre genomu içine entegre edilmiştir. Böylece, istikrarlı transfection genellikle ayrılmış bir araştırma içine uzun vadeli genetik düzenleme yöntemidir. Xenografts in vivo modellerinde fare içine3çalışma olarak istikrarlı hücre kültürünü de nakledilen. Kararlı transfection iki kategoriye ayrılabilir: viral ve nonviral. Nonviral transfection için karşılaştırıldığında, viral enfeksiyon genler bir daha yüksek verimlilik4,5,6,7ile insan hücreleri daha çok içine aktarabilirsiniz. Ayrıca, tek bir klon istikrarlı hücre satırından homojenliği ve klonal saflık avantajı sunar.
Kontrolsüz hücre büyümesi ve bölünme kanser en ayırt edici özellikleri vardır. Klinik ayarları’nda, adl tip-in tümör8için birincil tedavi antimitotic ajanlardır. Ancak, bazı önemli kısıtlamalar antimitotic ajanların göz ardı edilemez. İlk olarak, bu chemotherapies istenmeyen kanserli hücreleri ile birlikte normal hücreleri de öldürebilir ve böylece, ciddi yan etkileri8‘ de neden olabilir. İkinci, antitubulin ilaçların tümörler, tübülin’ın her yerde ifade birçok farklı dokuların bir hücre iskeleti protein9,10olarak rağmen her türlü karşı etkili değildir. Antitubulin ajanlar karşı umut verici etkinlik gösterdi neden o belirsizdir yumurtalık, akciğer ve hematolojik kanser klinik tedavi, ancak değil böbrek, iki nokta üst üste ya da pankreas kanserlerinin11. Son olarak, hatta hastalarda tümör aynı tip antimitotics için farklı beklenmedik bir şekilde yanıt verebilirsiniz. Farklı hastaların klinik tedavi12‘ görülen farklı sonuçlar elde antimitotic ajanlara duyarlılığını etkiler bir anahtar efektör molekül olabilir. Böylece, potansiyel fark hassasiyetleri antimitotic tedaviye hastaların tedavi müdahaleler13en iyi duruma getirmek için dikkate alınmalıdır.
Bir yüksek-den geçerek tüm-genom siRNA kitaplık ekranı DR3 nakavt hassas hücreler bir rol DR3 için kemoterapi kaynaklı apoptosis14‘ te göstermek için antimitotic ilaçlara dirençli hale gösterdi. Tümör nekroz faktör reseptör (TNFR) süper bir üyesi olarak, hücre apoptosis çeşitli sistemleri15,16,17,18arabuluculuk DR3 bildirilmiştir. Böylece, biz kararlı hücre hatları DR3 hangi apoptosis antimitotic uyuşturucu neden moleküler mekanizmaları incelemek için overexpressing kurmak için yola çıktı. DR3 overexpression çalışmak için bir uygun hücre modeli insan kolon kanseri hücre satırı DR3 eksikliği bulundu HT29 ile sağlanabilir. Ayrıca, klinikte, Kolon kanserlerinin duyarsız antimitotic uyuşturucu19.
Bu makalede, bir HT29-DR3 istikrarlı cep hattından retroviral enfeksiyon nesil sağlayan bir yöntem açıklanmaktadır. Biz daha fazla western Blot kullanarak bu hücrelerde DR3 ifade doğrulamak ve antimitotic ajanlara duyarlılık bir hücre canlılığı tahlil ve morfolojik gözlem kullanarak değerlendirmek gösterir. Hücreler tek klonlar güçlendirilmiş ve böylece, homojen bir genetik arka plan avantajına sahip. Buna ek olarak, DR3 bayrak etiketinde hücresel DR3 görselleştirme için mikroskobu ve gen ifade ve protein etkileşim analizi tarafından biyokimyasal yaklaşım izin. Ayrıca, hücreler tümör ilerleme antimitotics vivo içinde14yanıt olarak daha ileri düzeyde çözümlemek farelerde xenografted olabilir.
Burada sunulan HT29-DR3 hücre sistemi nasıl antimitotics kanser hücreleri14öldürmek moleküler mekanizmaları eğitim için etkili bir araç teklif etti. Overexpression ve devirme hücre hatları gen fonksiyon türleri çalışmak için yaygın araçları olduğundan, bu iletişim kuralı kolayca adapte faiz veya diğer hücre satırları diğer genler ve böylece, yaygın olarak kullanılan bir yaklaşım döndü.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makale, HT29-DR3 istikrarlı hücre satırlarını oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır. HT29-DR3 hücreleri bir moleküler mekanizmaları tarafından antimitotic aracıları tarafından indüklenen apoptosis DR3 katkıda çalışmak için sağlar. Bu yaklaşım çok yönlü ve tekrarlanabilir. Yordamın başarılı olmasını sağlamak için Protokolü’nün dört anahtar adımlar dikkate alınması gerekir. İlk olarak, bir yüksek üretmek için yeterli virüs titresi bu Plat-A hücreleri % 80 – % 90 izd…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser hibe 53110000117 (GW için) ve Tsinghua Üniversitesi’nden (X.W. için) 043222019 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| DMEM | Invitrogen | C11965500BT | Supplemented with 10% FBS and 1% Penicilin/Streptomycin |
| Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7571 | |
| Paclitaxel | Selleck | S1150 | |
| pMXs-IRES-Blasicidin | Cell Biolabs | RTV-016 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| PBS | Invitrogen | C14190500BT | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Invitrogen | 25200056 | |
| 1,5-Dimethyl-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide | Santa Cruz | sc-134220 | |
| Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| Anti-mouse secondary antibody | |||
| anti-Flag antibody | Sigma | F-3165 | |
| HT29 cell line | ATCC | HTB-38 | |
| plat-A cell line | Cell Biolabs | RV-102 | |
| PVDF Immobilon-P | Millipore | IPVH00010 | |
| Cloning Cylinder | Sigma | C1059 | |
| Cell Imaging Multi-Mode Reader | Biotek | BTCYT3MV | |
| CKX53 Inverted Microscope | Olympus | CKX53 | |
| 12-well cell culture plates | Nest | 712001 | |
| 60 mm cell culture plates | Nest | 705001 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Nest | 601052 | |
| 0.22 μm steril filter | Millipore | SLGP033RB | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5810000327 | |
| 96 Well White Polystyrene Microplate | Corning | 3903 | |
| Western ECL Substrate | BIO-RAD | 1705060 | |
| ImageQuant LAS 4000 | GE Healthcare | ImageQuant LAS 4000 | |
| Decoloring Shaker | HINOTECH | TS-2000A | |
| Blasticidin | InvivoGen | ant-bl-1 | |
| Automated cell counter | BIO-RAD | TC 20 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985070 |
References
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Recillas-Targa, F. Multiple strategies for gene transfer, expression, knockdown, and chromatin influence in mammalian cell lines and transgenic animals. Molecular Biotechnology. 34 (3), 337-354 (2006).
- Daley, G. Q. Animal models of BCR/ABL-induced leukemias. Leukemia & Lymphoma. 11, 57-60 (1993).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. Sustained correction of X-linked severe combined immunodeficiency by ex vivo gene therapy. The New England. Journal of Medicine. 346 (16), 1185-1193 (2002).
- Roesler, J., et al. Third-generation, self-inactivating gp91(phox) lentivector corrects the oxidase defect in NOD/SCID mouse-repopulating peripheral blood-mobilized CD34+ cells from patients with X-linked chronic granulomatous disease. Blood. 100 (13), 4381-4390 (2002).
- Russell, W. C. Update on adenovirus and its vectors. Journal of General Virology. 81 (Pt 11), 2573-2604 (2000).
- Wasala, N. B., Shin, J. H., Duan, D. The evolution of heart gene delivery vectors. The Journal of Gene Medicine. 13 (10), 557-565 (2011).
- Zhou, J., Giannakakou, P. Targeting microtubules for cancer chemotherapy. Current Medicinal Chemistry – Anti-Cancer Agents. 5 (1), 65-71 (2005).
- Rovini, A., Savry, A., Braguer, D., Carre, M. Microtubule-targeted agents: when mitochondria become essential to chemotherapy. Biochimica et Biophysica Acta. 1807 (6), 679-688 (2011).
- Bhalla, K. N. Microtubule-targeted anticancer agents and apoptosis. Oncogene. 22 (56), 9075-9086 (2003).
- Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nature Reviews Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
- Bhat, K. M., Setaluri, V. Microtubule-associated proteins as targets in cancer chemotherapy. Clinical Cancer Research. 13 (10), 2849-2854 (2007).
- Bates, D., Eastman, A. Microtubule destabilising agents: far more than just antimitotic anticancer drugs. British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (2), 255-268 (2017).
- Qi, C., et al. Anti-mitotic chemotherapeutics promote apoptosis through TL1A-activated death receptor 3 in cancer cells. Cell Research. 28 (5), 544-555 (2018).
- Marsters, S. A., et al. Apo-3, a new member of the tumor necrosis factor receptor family, contains a death domain and activates apoptosis and NF-kappa B. Current Biology. 6 (12), 1669-1676 (1996).
- Chinnaiyan, A. M., et al. Signal transduction by DR3, a death domain-containing receptor related to TNFR-1 and CD95. Science. 274 (5289), 990-992 (1996).
- Xu, L. X., et al. Death receptor 3 mediates TNFSF15- and TNFalpha-induced endothelial cell apoptosis. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 55, 109-118 (2014).
- Wen, L., Zhuang, L., Luo, X., Wei, P. TL1A-induced NF-kappaB activation and c-IAP2 production prevent DR3-mediated apoptosis in TF-1 cells. Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 39251-39258 (2003).
- Nakayama, M., et al. Multiple pathways of TWEAK-induced cell death. Journal of Immunology. 168 (2), 734-743 (2002).
- Kitamura, T., et al. Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics. Experimental Hematology. 31 (11), 1007-1014 (2003).
- Wang, G., Shang, L., Burgett, A. W., Harran, P. G., Wang, X. Diazonamide toxins reveal an unexpected function for ornithine delta-amino transferase in mitotic cell division. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (7), 2068-2073 (2007).
- Hassan, M. S., von Holzen, U. Animal Model: Xenograft Mouse Models in Esophageal Adenocarcinoma. Methods in Molecular Biology. , 151-164 (2018).
- Potter, H., Heller, R. Transfection by electroporation. Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).
- Jacobsen, L., Calvin, S., Lobenhofer, E. Transcriptional effects of transfection: the potential for misinterpretation of gene expression data generated from transiently transfected cells. Biotechniques. 47 (1), 617-624 (2009).
- Hagen, L., Sharma, A., Aas, P. A., Slupphaug, G. Off-target responses in the HeLa proteome subsequent to transient plasmid-mediated transfection. Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (1), 84-90 (2015).
- Omidi, Y., et al. Microarray analysis of the toxicogenomics and the genotoxic potential of a cationic lipid-based gene delivery nanosystem in human alveolar epithelial a549 cells. Toxicology Mechanisms and Methods. 18 (4), 369-378 (2008).
