Listeria monocytogenes Infektion des Gehirns
Summary
Während der Infektion kann Listeria Monocytogenes überqueren der Blut – Hirn-Schranke um das Gehirn zu besiedeln. In diesem Protokoll veranschaulichen wir die bakterielle Besiedlung der Organe nach Infektion der Mäuse zu beurteilen. Ein Verfahren zur gesamten Organ Perfusion zur spezifischen Bestimmung der bakteriellen Zahlen in der Anwesenheit von durchführen steht zur Verfügung.
Abstract
Listeria Monocytogenes ist eine intrazelluläre bakterielle Erreger, die häufig von lebensmittelbedingten Infektionen zugeordnet ist. Die Fähigkeit von L. Monocytogenes , überqueren Sie die Blut – Hirn-Schranke (BBB) ist über, wie es zu lebensbedrohlichen Meningitis und Enzephalitis führen kann. Die BBB schützt das Gehirn Mikroumgebung von verschiedenen toxischen Metaboliten und mikrobielle Krankheitserreger im Blut nach Infektion gefunden und unterstützt damit Gehirn Homöostase. Die Mechanismen, durch die L. Monocytogenes in den Blutkreislauf vorhanden überqueren die BBB verursachen Gehirn, die Infektionen nicht vollständig verstanden sind und es fehlt auch an ein stabiles Modellsystem Gehirn Infektionen von L. Monocytogeneszu studieren. Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache Mausmodell Infektion zu bestimmen, ob Bakterien die BBB überquert haben und die Belastung durch Bakterien quantitate, die das Gehirn in Vivobesiedelt haben. Bei dieser Methode Tiere wurden intravenös mit L. Monocytogenes infiziert und wurden durch die Einwirkung von CO2 gefolgt von zervikale Dislokation Human eingeschläfert. Kardiale Perfusion der Tiere erfolgte vor der Ernte infizierter Organen. Blut war vor Perfusion gesammelt und die Anzahl der Bakterien pro Organ oder mL Blut wurde bestimmt durch Ausplattieren Verdünnungen von Blut oder Orgel Homogenates auf Agarplatten und zählen die Anzahl der Kolonien gebildet. Diese Methode kann verwendet werden, um neuartige Rezeptor-Ligand-Interaktionen zu untersuchen, die Infektion des Gehirns von L. Monocytogenes und kann für die Untersuchung von mehreren bakteriellen Krankheitserregern leicht angepasst werden.
Introduction
Das grampositive Bakterium Listeria Monocytogenes ist ein fakultativ intrazellulärer Erreger und von der meisten tödlichen lebensmittelbedingten Krankheitserregern weltweit. Einnahme von L. Monocytogenes kontaminierte Lebensmittel führen zu Listeriose beim Menschen eine schwere invasive Erkrankung gezielt vor allem Schwangere, Neugeborene, die älteren und immungeschwächten Menschen1. L. Monocytogenes gehört zu den führenden Todesursachen durch ein Lebensmittel übertragbaren Erreger in den USA und Fall Sterberaten von Listeriose sind so hoch wie 20-30 %, die höchste für alle lebensmittelbedingten Krankheitserregern2. Derzeit existiert kein Impfstoff für L. Monocytogenes und die Fähigkeit der Bakterien, für distale Organe und das Gehirn effektiv zu verbreiten, durch die Kreuzung der Blut – Hirn-Schranke (BBB) führen zu lebensbedrohlichen Hirnhautentzündung und Kolonisierung des Gehirns3 , 4 , 5 , 6. bakterielle Meningitis ist in der Regel schwere; während die meisten Menschen, die Behandlung erholen, können Infektionen schwerwiegende Komplikationen, z.B., Hirnschäden, Hörverlust oder Lernbehinderungen bei Kindern verursachen. L. Monocytogenes wird vorausgesagt, um mindestens 10 % der ganzen Gemeinschaft berücksichtigen Meningitis in der US-7erworben.
Eine wichtige Route für bakterielle Verbreitung des Gehirns und der Hirnhäute wird durch den Blutstrom. Bakterien im Umlauf in den Blutgefäßen im Gehirn sind in der Lage die BBB zum Gehirn zu Infektionen führen zu überqueren. Die BBB ist ein stark vaskularisierte Barriere, die das Gehirn vor Fremdkörper im Blut zirkulierenden schützt. Endothelzellen bilden eine Schicht, die die innere Oberfläche der Blutgefäße8,9Linien. Neben L. Monocytogeneskönnen mehrere bakterielle Krankheitserreger wie Neisseria Meningitidis, Streptococcus Pneumoniae, Escherichia coliund Haemophilus Influenzae Typ B (Hib) besiedeln das Gehirn durch die Kreuzung der BBB3,4,5,6. Bakterielle Belastungen im Gehirn von infizierten Mäusen untersucht, ist es jedoch wichtig zu bestimmen, ob Bakterien die BBB überquert haben, ansonsten die bakterielle Belastung im Gehirn Bakterien darstellen kann, die noch in den Blutgefäßen des Gehirns sind. Daher ist es notwendig, die Mäuse alles Blut vor der Festlegung der koloniebildenden Einheiten (KBE) des Gehirns Homogenates durchspülen.
In dieser Studie beschreiben wir in-Vivo -Methoden um L. Monocytogenes -Infektion des Gehirns zu untersuchen. Für die hier beschriebenen Methoden verwendet wir L. Monocytogenes Stamm 10403S. L. Monocytogenes 10403S ist eines der am weitesten verbreitete laborbelastungen systemische Listeriose im Mausmodell der Infektion10zu studieren. Dieses Protokoll basiert auf standard intravenöse Injektion von L. Monocytogenes gefolgt von Perfusion der Mäuse. Abbildung 1zeigt ein schematischer Überblick über die Infektion Protokoll bei Mäusen. L. Monocytogenes-infizierten Gehirn und andere Organe von nicht durchblutet oder PERFUNDIERTEN Mäuse wurden gesammelt und die bakterielle Orgel Belastung bestimmt. Diese Methoden eignen sich für die Bestimmung nicht nur total bakteriellen Besiedelung des Gehirns bei infizierten Tieren, sondern sind auch vorteilhaft zur Feststellung, ob Bakterien die BBB in Vivo , Invasion des Gehirns zu vermitteln eingedrungen sind. Es ist wichtig hervorzuheben, dass diese Laborprotokoll durchgeführt werden sollte, nach Rücksprache mit dem relevanten institutionellen Biosafety Committee und Tier Facilitymanagement.
Protocol
Representative Results
Discussion
L. Monocytogenes kann lebensbedrohliche Meningoenzephalitis beim Menschen verursachen. Vorherige Studien belegen die Fähigkeit von Bakterien, die Blut-Hirn-Schranke (BBB) zu überqueren und um das Gehirn zu kolonisieren. Drei Strecken der Gehirn-Invasion wurden vorgeschlagen, während der Infektion: direkte Penetration des BBB durch Bakterien, Stealth-Transport durch Bakterien in mononukleären Zellen3und axonalen Migration von L. Monocytogenes Stämme, die dazu führen, dass Rh…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch US Public Health Service gewähren AI103806 von den National Institutes of Health.
Materials
| Brain Heart Infusion media | Becton Dickinson | 237200 | |
| Streptomycin sulfate | Amresco | 0382-50G | |
| Petri dishes | VWR | 25384-342 | |
| Glycerol | VWR | 97062-832 | |
| IKA T18 ULTRA-TURRAX Basic Homogenizer | IKA | 3352109 | Model: T18BS1 |
| Spectrophotometer | Beckman Coulter | DU 800 series | |
| BALB/c mice | Jackson Laboratory | Model #000651 | |
| 1 mL syringes | Becton Dickinson | 309659 | |
| 26-gauge needles | Becton Dickinson | 305115 | |
| 21-gauge butterfly needles | Becton Dickinson | 367281 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 60004 | |
| 15 mL conical tubes | VWR | 21008-918 | |
| Round-bottom test tubes | VWR | 60819-546 | |
| Phosphate-buffered saline | Corning | 46-013-CM | |
| Stainless steel spatula | VWR | 82027-520 | |
| Stainless steel scissors (6.5 in) | VWR | 82027-592 | |
| Stainless steel scissors (4.5 in) | VWR | 82027-578 | |
| Stainless steel blunt forceps (4.5 in) | VWR | 82027-440 | |
| Stainless steel fine tip forceps (6 in) | VWR | 82027-406 |
References
- Radoshevich, L., Cossart, P. Listeria monocytogenes: towards a complete picture of its physiology and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 16 (1), 32-46 (2018).
- de Noordhout, C. M., et al. The global burden of listeriosis: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Infectious Diseases. 14 (11), 1073-1082 (2014).
- Drevets, D. A., Leenen, P. J., Greenfield, R. A. Invasion of the central nervous system by intracellular bacteria. Clinical Microbiology Reviews. 17 (2), 323-347 (2004).
- Huang, S. H., Stins, M. F., Kim, K. S. Bacterial penetration across the blood-brain barrier during the development of neonatal meningitis. Microbes and Infection. 2 (10), 1237-1244 (2000).
- Brouwer, M. C., Tunkel, A. R., van de Beek, D. Epidemiology, diagnosis, and antimicrobial treatment of acute bacterial meningitis. Clinical Microbiology Reviews. 23 (3), 467-492 (2010).
- Thigpen, M. C., et al. Bacterial meningitis in the United States, 1998-2007. New England Journal of Medicine. 364 (21), 2016-2025 (2011).
- Durand, M. L., et al. Acute bacterial meningitis in adults. A review of 493 episodes. The New England Journal of Medicine. 328 (1), 21-28 (1993).
- Disson, O., Lecuit, M. Targeting of the central nervous system by Listeria monocytogenes. Virulence. 3 (2), 213-221 (2012).
- Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), a020412 (2015).
- Becavin, C., et al. Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity. MBio. 5 (2), e00969-e00914 (2014).
- Kirchner, M., Higgins, D. E. Inhibition of ROCK activity allows InlF-mediated invasion and increased virulence of Listeria monocytogenes. Molecular Microbiology. 68 (3), 749-767 (2008).
- Grubaugh, D., et al. The VirAB ABC transporter is required for VirR regulation of Listeria monocytogenes virulence and resistance to nisin. Infection and Immunity. 86 (3), 901-917 (2018).
- Vazquez-Boland, J. A., et al. Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants. Clinical Microbiology Reviews. 14 (3), 584-640 (2001).
- Ghosh, P., et al. Invasion of the brain by Listeria monocytogenes is mediated by InlF and host cell vimentin. MBio. 9 (1), e00160-e00118 (2018).
- Henke, D., et al. Listeria monocytogenes spreads within the brain by actin-based intra-axonal migration. Infection and Immunity. 83 (6), 2409-2419 (2015).
- Maury, M. M., et al. Uncovering Listeria monocytogenes hypervirulence by harnessing its biodiversity. Nature Genetics. 48 (3), 308-313 (2016).
