Protein Kinase C-Delta-Inhibitor Peptid Formulierung mit Gold-Nanopartikeln
Summary
Wir haben mit eine gold-Nanopartikel-Peptid-Hybrid früher intravenös liefern einen synthetischen Peptid, Protein-Kinase C-Delta-Hemmer, die Ischämie-Reperfusion-induzierten akuten Lungenversagen reduziert. Hier zeigen wir das ausführliche Protokoll der Arzneistoff-Formulierung. Anderen intrazellulären Peptide können in ähnlicher Weise formuliert werden.
Abstract
Protein C-Delta-Kinase-Inhibitor (PKCδi) ist ein vielversprechendes Medikament, Ischämie-Reperfusion-induzierte Orgel Verletzungen zu vermeiden. Es ist in der Regel an eine Zelle eindringen Peptid, TAT, für die intrazelluläre Lieferung konjugiert. Allerdings hat TAT unspezifische biologische Aktivitäten gezeigt. Gold-Nanopartikel (festzulegenden) kann als Droge Anlieferung Träger ohne anerkannte Toxizität verwendet werden. Daher haben wir eine GNP/Peptid-Hybrid verwendet, um PKCδi zu liefern. Zwei kurze Peptide (P2: CAAAAE und P4: CAAAAW), in einem 95:5 Verhältnis, wurden verwendet, um die Oberflächeneigenschaften des BSP zu ändern. Festzulegenden konjugiert mit PKCδi (GNP/PKCi) sind stabil in destilliertem Wasser, 0,9 % NaCl und Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), bovine Serum Albumin oder fötalen Rinderserum enthalten. Intravenöser Injektion von GNP-PKCi zeigte zuvor Ischämie-Reperfusion Verletzungen der Lunge zu vermeiden. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur GNP/PKCi zu formulieren und bewerten die physiochemischen Eigenschaften des GNP/PKCi. Wir haben ähnliche Methoden verwendet, um andere Peptid-basierte Medikamente mit BSP zu formulieren. Dieser Artikel wird hoffentlich mehr Aufmerksamkeit auf dieses neuartige intrazellulären Drug-Delivery-Technologie und ihre Anwendungen in-vivo ziehen.
Introduction
Lungen-Transplantation erspart Patienten mit terminaler Lunge Krankheit1. Schwere Komplikationen nach Lungentransplantation bleiben jedoch ein Hindernis. In den frühen Stadien nach Lungentransplantation, primäre Graft Dysfunktion ist die schädlichste Komplikation1und seine Hauptursache ist Ischämie-Reperfusion (IR)-induzierten akuten Lungen-Verletzungen2.
Unter kalten Erhaltung ist Stoffwechsel in einem Spender Lunge beschränkt sich auf einem sehr niedrigen Niveau. Jedoch werden reaktive Sauerstoffspezies und Stickoxid-Synthese aufgrund der Einstellung der Blut fließen3aktiviert. Nach der Transplantation Durchblutung der Haut wird wiederhergestellt und reaktive Sauerstoffspezies und Stickoxid erzeugt während der kalten Ischämie verbessern Entzündung und Zelle Tod, was zu Gewebeschäden.
Zur Vermeidung von Verletzungen IR wurde ein Protein Kinase Cδ Inhibitor (PKCδi) in das Herz, Gehirn und Lunge4,5,6,7,8verwendet. Diese Studien zeigten, dass PKCδi Entzündung und Apoptose während Reperfusion abgenommen. Es hat auch pulmonale IR Verletzung bei Ratten und in eine Lungen-Transplantation Modell6verhindert. PKCδi ist in der Regel mit einer Zelle eindringen Peptid, TAT, für die intrazelluläre Lieferung konjugiert. Jedoch hat gezeigt, dass die TAT Peptid allein nicht spezifische biologische Wirkungen, einschließlich der Förderung der Angiogenese, Apoptose und Hemmung der mehrere Zytokine9,10,11hat. Nanopartikel, kleine Partikel von 1 bis 100 nm im Durchmesser12, als Kandidaten bei der Erleichterung der Droge Lieferung13erkundet worden. Insbesondere gelten goldene-Nanopartikeln (festzulegenden) als nicht-invasive und ungiftig. Daher haben wir als Medikament Anlieferung Träger für Peptid-basierte Medikamente14,15festzulegenden entwickelt.
Die Oberfläche des festzulegenden kann für spezielle Anwendungen wie molekulare Erkennung16,17, chemische Sensor18, bildgebenden19und Drug-Delivery manipuliert werden. GNP/Peptid-Hybrid-System entwickelt wurde, mit 20 nm festzulegenden und zwei kurze Peptide (P2: CAAAAE und P4: CAAAAW) in einem 95:5 Verhältnis, die Oberflächeneigenschaften der festzulegenden ändern. Das P2-Peptid mit der negativ geladenen Glutaminsäure (E) am Ende, stabilisiert festzulegenden in einer wässrigen Lösung, und das P4-Peptid mit der hydrophoben Tryptophan (W) am Ende hilft festzulegenden Eingang in Zellen14. Cystein (C) Rückstände am N-Terminus dieser Peptide enthält eine Thiol-Gruppe, die in den Goldflächen14konjugieren kann. Dieses Peptid/GNP-Hybrid wurde weiter verwendet, um PKCδi (CSFNSYELGSL) zu liefern. Das optimierte molare Verhältnis von P2:P4 zu PKCδi ist 47.5:2.5:50. Festzulegenden konjugiert mit PKCδi (GNP/PKCi) werden in destilliertem Wasser, 0,9 % NaCl und PBS mit bovinen Albumin oder fötalen Rinderserum14stabil. Intravenöser Injektion von GNP/PKCi hat sich gezeigt, Ischämie-Reperfusion Verletzungen der Lunge15zu vermeiden. Dieser Artikel beschreibt eine Methode, um GNP/PKCi formulieren und beschreibt, wie die physikalisch-chemischen Eigenschaften des GNP/PKCi zu bewerten. Wir haben ähnliche Methoden verwendet, um andere Peptid-basierte Medikamente zu GNP20,21,22konjugiert zu formulieren. Wir hoffen, dass dieser Artikel mehr Aufmerksamkeit auf diese neuartige Formulierung zur intrazellulären Wirkstoffabgabe ziehen wird.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um die richtige Formulierung zu gewährleisten, ist es entscheidend, dass die δPKCi Lösung den Beschallung Schritt in 1.6 beschrieben erfährt. ΔPKCi Peptidsequenz enthält hydrophoben Moieties, so dass ein Sonikator hilft bei der Auflösung von PKCi in der 50 % Acetonitril-Lösung. Darüber hinaus ist es sehr wichtig, um das Lösungsmittel akribisch, wie in Schritt 2.7 beschrieben mischen. Die GNP/PKCi-Hybrid wird nicht gut formuliert werden, wenn diese Schritte nicht richtig durch die Aggregation der δPKCi Peptid…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit stützt sich auf Forschungsstipendien von Canadian Institutes of Health Research (PJT-148847), Ministerium für Forschung und Innovation von Ontario (RE-08-029) und Kanada erste Forschung der Excellence Program, Medizin von Design an der University of Toronto. Dr. Mingyao Liu ist James und Mary Davie Stuhl Lungenschädigung, Reparatur und Regeneration.
Materials
| negatively charged glutamic acid peptide (P2) | CanPeptide | Sequence: CAAAAE-NH2 Length: 6aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
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| hydrophobic tryptophan peptide (P4) | CanPeptide | Sequence: CAAAAW-NH2 Length: 6aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
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| δPKCi peptide | CanPeptide | Seqeuence: CSFNSYELGSL-NH2 Length: 11aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
|
| Conical tube(50ml) | Corning Life Sciences | 3582070 | |
| Conical tube(15ml) | Corning Life Sciences | 3582096 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004-100ML | |
| Sonicator | Branson Ultrasonics Corp. | Branson 2510MTH | |
| Microtube | Diamed.ca | AD 150-N | |
| Gold nanoparticle solution | Ted Pella | 15705-5 | A particle size is 20nm |
| Rocking Platform shaker | VWR international | 40000-304 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Acryl cuvette | SARSREDT | 67.758 | |
| UV-Vis spectrophotometer | Agilent | Caty 60 UV-Vis |
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