金ナノ粒子を用いた蛋白質キナーゼ C デルタ阻害ペプチド製剤
Summary
静脈内合成ペプチド、蛋白質キナーゼ C デルタ阻害剤は、虚血再灌流惹起急性肺傷害の減少を提供する金ナノ粒子のペプチド ハイブリッド以前使いました。ここで、製剤の詳細なプロトコルを示す.他の細胞内ペプチドは同様に定式化することができます。
Abstract
蛋白質キナーゼ C デルタ阻害剤 (PKCδi) は、虚血再灌流による臓器損傷を防ぐために有望な薬剤です。通常、細胞透過性ペプチド、TAT の細胞内動態を活用します。しかし、TAT は、非固有の生物学的活性を示しています。金ナノ粒子 (GNPs) は、認識された毒性のない薬配信キャリアとして使用できます。したがって、我々 は PKCδi を提供する GNP/ペプチド ハイブリッドを使いました。2 つの短いペプチド (P2: CAAAAE と P4: CAAAAW)、95:5 の比率で GNP のサーフェスのプロパティを変更する使用されました。GNPs PKCδi (GNP/PKCi) と共役が蒸留水で安定して 0.9% 塩化ナトリウムとリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) ウシ血清アルブミンやウシ胎児血清を含みます。GNP PKCi の静脈注射は以前肺の虚血再灌流障害を防ぐために示されました。この資料では、GNP/PKCi を策定し、ハンナラ党/PKCi の理化学特性を評価するためのプロトコルについて説明します。ハンナラ党と他のペプチド ベースの薬を策定する同じような方法を使いました。この記事は、うまく行けばこの細胞内薬剤デリバリー技術とその応用を体内にもっと注意を引くでしょう。
Introduction
肺移植は末期肺疾患1患者を保存します。ただし、肺移植後の重篤な合併症では、障害が残っています。肺移植初期段階で主な移植臓器機能不全は最も有害な合併症1で、その主な原因は虚血再灌流 (IR)-誘発急性肺傷害2。
低温保蔵下ドナー肺における代謝は非常に低いレベルに制限されます。しかし、活性酸素と一酸化窒素合成血流3の停止のためにアクティブ化されます。移植後血行が復元され、活性酸素種と冷たい虚血時に生成される酸化窒素を高める組織の損傷に伴う炎症や細胞死。
IR の傷害を防ぐためには、蛋白質キナーゼ c δ 阻害剤 (PKCδi) は、心、脳と肺4,5,6,7,8で使用されています。これらの研究は、PKCδi が、再灌流時に、炎症とアポトーシスを減少することを示した。それはまた肺の IR 損傷ラットおよび肺移植モデル6を許可していません。PKCδi は通常、細胞浸透性ペプチド、TAT の細胞内動態と共役系します。ただし、単独で TAT ペプチドが複数サイトカイン9,10,11の阻害、アポトーシス、血管新生の促進を含む非固有生物学的効果を持っていることが示されています。ナノ粒子、1 から 100 までの小粒子径12nm は薬配信13を容易に候補として検討されています。特に、金ナノ粒子 (GNPs) は無毒、非侵襲的にみなされます。そこで、ペプチド ベースの薬14,15薬配信キャリアとして GNPs を開発しました。
GNPs の表面は、分子認識16,17、化学センシング18、イメージング19、薬剤投与などの特定のアプリケーションを操作できます。20 nm GNPs と 2 つの短いペプチドを含む、ハンナラ党/ペプチド ハイブリッド システムを開発されている (P2: CAAAAE と P4: CAAAAW) GNPs の表面の特性を変更するのには、95:5 の比率で。P2 ペプチド、最後に、負荷電のグルタミン酸 (E) を水溶液中で GNPs を安定化し、最後に、疎水性トリプトファン (W) と、P4 のペプチドに役立ちます GNPs セル14への入口。これらのペプチドの N 末端のシステイン (C) 残基には、金表面14に共役することができますチオール グループが含まれています。このペプチド/GNP ハイブリッドはさらに PKCδi (CSFNSYELGSL) を提供する使用されました。PKCδi に P2:P4 の最適化のモル比は、47.5:2.5:50 です。GNPs PKCδi (GNP/PKCi) と共役安定蒸留水、0.9% の NaCl、牛アルブミンまたはウシ胎児血清14を含む PBS が。GNP/PKCi の静脈注射は、15肺の虚血再灌流障害を防ぐために示されています。この記事では、GNP/PKCi を定式化する方法の概要を説明し、ハンナラ党/PKCi の物理化学的特性を評価する方法について説明します。他のペプチド ベースの薬 GNP20,21,22に共役を策定する同じような方法を使いました。この記事がこの新規製剤細胞内薬物送達のためにもっと注目されると思います。
Protocol
Representative Results
Discussion
適切な定式化を確保するため、δPKCi ソリューションが 1.6 で説明されている超音波処理ステップを経ることが重要です。ΔPKCi ペプチッド シーケンスには、50% アセトニ トリル溶液中 PKCi を溶解に役立ちます、超音波発生装置、疎水性の部分が含まれています。さらに、細心、手順 2.7 に示した溶媒を混合する非常に重要です。 23δPKCi ペプチドの凝集による手順が適切に行わ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、カナダ最初研究の卓越性のプログラム、トロント大学でデザインによる医療とオンタリオ州の革新 (日時-08-029) 研究省健康の研究のカナダの協会 (PJT-148847) からの研究補助金によってサポートされます。Mingyao リューはジェームズと肺の損傷、修復、および再生のメアリー デイビー椅子です。
Materials
| negatively charged glutamic acid peptide (P2) | CanPeptide | Sequence: CAAAAE-NH2 Length: 6aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
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| hydrophobic tryptophan peptide (P4) | CanPeptide | Sequence: CAAAAW-NH2 Length: 6aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
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| δPKCi peptide | CanPeptide | Seqeuence: CSFNSYELGSL-NH2 Length: 11aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
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| Conical tube(50ml) | Corning Life Sciences | 3582070 | |
| Conical tube(15ml) | Corning Life Sciences | 3582096 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004-100ML | |
| Sonicator | Branson Ultrasonics Corp. | Branson 2510MTH | |
| Microtube | Diamed.ca | AD 150-N | |
| Gold nanoparticle solution | Ted Pella | 15705-5 | A particle size is 20nm |
| Rocking Platform shaker | VWR international | 40000-304 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Acryl cuvette | SARSREDT | 67.758 | |
| UV-Vis spectrophotometer | Agilent | Caty 60 UV-Vis |
References
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