Proteína quinase C-delta inibidor do Peptide formulação utilizando nanopartículas de ouro
Summary
Anteriormente nós usamos um híbrido de peptídeo de nanopartículas de ouro para entregar por via intravenosa um peptídeo sintético, inibidor da proteína quinase C-delta, que reduziu a lesão pulmonar aguda induzida por isquemia-reperfusão. Aqui nós mostramos o protocolo detalhado da formulação da droga. Outros peptídeos intracelulares podem ser formulados da mesma forma.
Abstract
Inibidor de proteína quinase C-delta (PKCδi) é uma droga promissora para prevenir lesões de isquémia-reperfusão-induzida do órgão. Isso geralmente é conjugado a um célula-penetrante do peptide, TAT, para entrega intracelular. No entanto, TAT demonstrou atividades biológicas inespecíficas. Nanopartículas de ouro (PNB) podem ser usadas como portadores de entrega de droga sem toxicidade reconhecida. Portanto, usamos um híbrido de GNP/peptídeo para entregar PKCδi. Dois curtos peptídeos (P2: CAAAAE e P4: CAAAAW), em uma relação de 95:5, foram utilizados para modificar as propriedades da superfície do PNB. PNB conjugados com PKCδi (GNP/PKCi) são estáveis em água destilada, 0,9% de NaCl e fosfato salino (PBS) contendo albumina de soro bovino ou soro fetal bovino. Injeção intravenosa de GNP-PKCi anteriormente foi mostrada para prevenir lesões de isquémia-reperfusão do pulmão. Este artigo descreve um protocolo para formular o GNP/PKCi e avaliar as propriedades físico-químicas do GNP/PKCi. Nós usamos métodos semelhantes para formular outras drogas baseado em peptídeo com PNB. Este artigo espero que vai chamar mais atenção para esta tecnologia de entrega de droga intracelular romance e suas aplicações em vivo.
Introduction
Transplante de pulmão salva pacientes com estágio final de doença pulmonar1. No entanto, sérias complicações após transplante de pulmão permanecem um obstáculo. Nas fases iniciais após transplante pulmonar, disfunção primária do enxerto é a complicação mais nocivos1, e sua principal causa é isquemia-reperfusão (IR)-induzida de lesão pulmonar aguda2.
Sob fria preservação, metabolismo em um pulmão de doador é restrito a um nível muito baixo. No entanto, espécies reativas de oxigênio e síntese de óxido nítrico são ativados devido a cessação do fluxo de sangue3. Após transplante, circulação de sangue é restaurada, e espécies reativas de oxigênio e óxido nítrico gerado durante a isquemia fria aumentar a inflamação e célula morte, resultando em lesão tecidual.
Para evitar lesões IR, inibidor de proteína quinase Cδ (PKCδi) tem sido usado no coração, cérebro e pulmão4,5,6,7,8. Estes estudos mostraram que PKCδi diminuição da inflamação e apoptose durante a reperfusão. Ele também impediu a lesão pulmonar de IR em ratos e em um modelo de transplante de pulmão6. PKCδi é geralmente conjugado com um célula-penetrante do peptide, TAT, para entrega intracelular. No entanto, ficou demonstrado que o peptídeo TAT sozinho tem efeitos biológicos não-específica, incluindo a promoção da angiogênese, apoptose e inibição de várias citocinas9,10,11. Nanopartículas, pequenas partículas que variam de 1 a 100 nm de diâmetro12, tem sido explorado como candidatos para facilitar a entrega de drogas13. Em particular, nanopartículas de ouro (PNB) são consideradas como não-invasivo e não tóxico. Portanto, nós desenvolvemos o PNB como portadores de entrega de droga para drogas baseado em peptídeo14,15.
A superfície do PNB pode ser manipulada para aplicações específicas, tais como reconhecimento molecular16,17, sensoriamento químico18, imagem19e entrega da droga. Foi desenvolvido um sistema híbrido de GNP/peptídeo, contendo 20 nm PNB e dois peptídeos curtos (P2: CAAAAE e P4: CAAAAW) na proporção de 95:5, para modificar as propriedades da superfície do PNB. O peptídeo de P2, com o ácido glutâmico carregado negativamente (E) no final, estabiliza o PNB em solução aquosa, e o peptídeo P4, com o triptofano hidrofóbico (W), no final, ajuda dos PNB entrada em células14. O resíduo de cisteína (C) no terminal N destes peptídeos contém um grupo tiol que pode conjugar para as superfícies de ouro14. Este híbrido de peptídeo/PIB era mais usado para entregar PKCδi (CSFNSYELGSL). A relação molar otimizada de P2:P4 para PKCδi é 47.5:2.5:50. PNB conjugados com PKCδi (GNP/PKCi) são estáveis em água destilada, 0,9% NaCl e PBS contendo Albumina bovina ou soro fetal bovino14. Injeção intravenosa de GNP/PKCi foi mostrada para prevenir lesões de isquémia-reperfusão do pulmão15. Este artigo descreve um método para a formulação de GNP/PKCi e descreve como avaliar as propriedades físico-químicas do GNP/PKCi. Nós usamos métodos semelhantes para formular outras drogas baseado em peptídeo conjugadas a GNP20,21,22. Esperamos que este artigo vai chamar mais atenção para esta formulação romance para entrega de drogas intracelular.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para garantir a formulação adequada, é fundamental que a solução de δPKCi sofre a etapa sonication descrita no 1.6. ΔPKCi sequência de peptídeo contém partes hidrofóbicas, então um sonicador auxilia na dissolução de PKCi na solução 50% acetonitrila. Além disso, é muito importante misturar o solvente meticulosamente, conforme descrito na etapa 2.7. O híbrido de GNP/PKCi não vai ser formulado bem se estas etapas não forem feitas corretamente, devido a agregação da δPKCi peptídeo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho é apoiado por bolsas de investigação do canadense institutos de pesquisa em saúde (PJT-148847), Ministério de pesquisa e inovação de Ontário (RE-08-029) e Canadá primeira pesquisa do programa de excelência, medicina de Design na Universidade de Toronto. Dr. Mingyao Liu é James e Mary Davie cadeira em lesão pulmonar, reparação e regeneração.
Materials
| negatively charged glutamic acid peptide (P2) | CanPeptide | Sequence: CAAAAE-NH2 Length: 6aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
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| hydrophobic tryptophan peptide (P4) | CanPeptide | Sequence: CAAAAW-NH2 Length: 6aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
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| δPKCi peptide | CanPeptide | Seqeuence: CSFNSYELGSL-NH2 Length: 11aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
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| Conical tube(50ml) | Corning Life Sciences | 3582070 | |
| Conical tube(15ml) | Corning Life Sciences | 3582096 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004-100ML | |
| Sonicator | Branson Ultrasonics Corp. | Branson 2510MTH | |
| Microtube | Diamed.ca | AD 150-N | |
| Gold nanoparticle solution | Ted Pella | 15705-5 | A particle size is 20nm |
| Rocking Platform shaker | VWR international | 40000-304 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Acryl cuvette | SARSREDT | 67.758 | |
| UV-Vis spectrophotometer | Agilent | Caty 60 UV-Vis |
References
- Yusen, R. D., et al. The registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: thirty-first adult lung and heart-lung transplant report–2014; focus theme: retransplantation. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 33 (10), 1009-1024 (2014).
- Lee, J. C., Christie, J. D., Keshavjee, S. Primary graft dysfunction: definition, risk factors, short- and long-term outcomes. Seminars in Respiratory and Critical. 31 (2), 161-171 (2010).
- Chatterjee, S., Nieman, G. F., Christie, J. D., Fisher, A. B. Shear stress-related mechanosignaling with lung ischemia: lessons from basic research can inform lung transplantation. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (9), 668-680 (2014).
- Inagaki, K., et al. Inhibition of delta-protein kinase C protects against reperfusion injury of the ischemic heart in vivo. Circulation. 108 (19), 2304-2307 (2003).
- Lincoff, A. M., et al. Inhibition of delta-protein kinase C by delcasertib as an adjunct to primary percutaneous coronary intervention for acute anterior ST-segment elevation myocardial infarction: results of the PROTECTION AMI Randomized Controlled Trial. European Heart Journal. 35 (37), 2516-2523 (2014).
- Kim, H., et al. deltaV1-1 Reduces Pulmonary Ischemia Reperfusion-Induced Lung Injury by Inhibiting Necrosis and Mitochondrial Localization of PKCdelta and p53. American Journal of Transplantation. 16 (1), 83-98 (2016).
- Lin, H. W., et al. Derangements of post-ischemic cerebral blood flow by protein kinase C delta. 신경과학. 171 (2), 566-576 (2010).
- Lin, H. W., et al. Protein kinase C delta modulates endothelial nitric oxide synthase after cardiac arrest. Journal of Cerebral Blood Flow Metabolism. 34 (4), 613-620 (2014).
- Albini, A., et al. HIV-tat protein is a heparin-binding angiogenic growth factor. Oncogene. 12 (2), 289-297 (1996).
- Kim, H., Moodley, S., Liu, M. TAT cell-penetrating peptide modulates inflammatory response and apoptosis in human lung epithelial cells. Drug Delivery and Translational Research. 5 (3), 275-278 (2015).
- Lee, D., Pacheco, S., Liu, M. Biological effects of Tat cell-penetrating peptide: a multifunctional Trojan horse. Nanomedicine (Lond). 9 (1), 5-7 (2014).
- Auffan, M., et al. Towards a definition of inorganic nanoparticles from an environmental, health and safety perspective. Nature Nanotechnology. 4 (10), 634-641 (2009).
- Ghosh, P., Han, G., De, M., Kim, C. K., Rotello, V. M. Gold nanoparticles in delivery applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 60 (11), 1307-1315 (2008).
- Yang, H., Fung, S. Y., Liu, M. Programming the cellular uptake of physiologically stable peptide-gold nanoparticle hybrids with single amino acids. Angewandte Chemie International Edition. 50 (41), 9643-9646 (2011).
- Lee, D., et al. Effective delivery of a rationally designed intracellular peptide drug with gold nanoparticle-peptide hybrids. Nanoscale. 7 (29), 12356-12360 (2015).
- Cheng, M. M., et al. Nanotechnologies for biomolecular detection and medical diagnostics. Current Opinion in Chemical Biology. 10 (1), 11-19 (2006).
- Rosi, N. L., Mirkin, C. A. Nanostructures in biodiagnostics. Chemical Reviews. 105 (4), 1547-1562 (2005).
- Saha, K., Agasti, S. S., Kim, C., Li, X., Rotello, V. M. Gold nanoparticles in chemical and biological sensing. Chemical Reviews. 112 (5), 2739-2779 (2012).
- Boisselier, E., Astruc, D. Gold nanoparticles in nanomedicine: preparations, imaging, diagnostics, therapies and toxicity. Chemical Society Reviews. 38 (6), 1759-1782 (2009).
- Yang, H., et al. Amino Acid-Dependent Attenuation of Toll-like Receptor Signaling by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. ACS Nano. 9 (7), 6774-6784 (2015).
- Yang, H., et al. Endosomal pH modulation by peptide-gold nanoparticle hybrids enables potent anti-inflammatory activity in phagocytic immune cells. Biomaterials. 111, 90-102 (2016).
- Yang, H., et al. Amino Acid Structure Determines the Immune Responses Generated by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. Particle & Particle Systems Characterization. 30 (12), 1039-1043 (2013).
- Pamies, R., et al. Aggregation behaviour of gold nanoparticles in saline aqueous media. Journal of Nanoparticle Research. 16 (4), (2014).
- Perrault, S. D., Walkey, C., Jennings, T., Fischer, H. C., Chan, W. C. Mediating tumor targeting efficiency of nanoparticles through design. Nano Letters. 9 (5), 1909-1915 (2009).
- Connor, E. E., Mwamuka, J., Gole, A., Murphy, C. J., Wyatt, M. D. Gold nanoparticles are taken up by human cells but do not cause acute cytotoxicity. Small. 1 (3), 325-327 (2005).
- Kim, C. K., et al. Entrapment of Hydrophobic Drugs in Nanoparticle Monolayers with Efficient Release into Cancer Cells. Journal of the American Chemical Society. 131 (4), 1360 (2009).
- Sonavane, G., Tomoda, K., Makino, K. Biodistribution of colloidal gold nanoparticles after intravenous administration: Effect of particle size. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces. 66 (2), 274-280 (2008).
- Balasubramanian, S. K., et al. Biodistribution of gold nanoparticles and gene expression changes in the liver and spleen after intravenous administration in rats. Biomaterials. 31 (8), 2034-2042 (2010).
- Lipka, J., et al. Biodistribution of PEG-modified gold nanoparticles following intratracheal instillation and intravenous injection. Biomaterials. 31 (25), 6574-6581 (2010).
