Met behulp van verbeterde eiwit-uiting van groene fluorescentie Escherichia Coli te beoordelen muis peritoneale Macrophage fagocytose
Summary
Hier presenteren we een protocol om te beoordelen van muis peritoneale macrofaag fagocytose met behulp van verbeterde groene fluorescentie eiwit-uiting van Escherichia coli.
Abstract
Dit manuscript beschrijft een eenvoudige en reproduceerbare methode voor het uitvoeren van een fagocytose assay. Het eerste deel van deze methode gaat om het bouwen van een huisdier-SUMO-EGFP vector (SUMO = kleine ubiquitin-achtige modifier) en uiting geven aan verbeterde groene fluorescentie eiwit (EGFP) in Escherichia coli (BL21DE). Uitdrukken van EGFP E. coli is coincubated met macrofagen gedurende 1 uur bij 37 ° C; de negatieve controlegroep is ge¨ uncubeerd op ijs de dezelfde hoeveelheid tijd. De macrofagen zijn klaar voor beoordeling. De voordelen van deze techniek bevatten zijn eenvoudig en duidelijk stappen en fagocytose kan worden gemeten door beide stroom cytometer en fluorescentie Microscoop. De uiting van EGFP E. coli zijn stabiel en een sterke fluorescentie signaal weergeven, zelfs nadat de macrofagen worden bevestigd met paraformaldehyde. Deze methode is niet alleen geschikt voor de beoordeling van macrofaag cellijnen of primaire macrofagen in vitro maar ook geschikt voor de evaluatie van granulocyt en monocyt fagocytose in perifere bloed mononucleaire cellen. Uit de resultaten blijkt dat het fagocytische vermogen van peritoneale macrofagen van jonge (acht weken oude) muizen hoger dan die van macrofagen van leeftijd (16-maand-oude) muizen is. Kortom, deze methode meet macrofaag fagocytose en is geschikt voor de bestudering van het aangeboren immuunsysteem.
Introduction
Macrophage fagocytose tests worden vaak gebruikt voor het bestuderen van het aangeboren immuunsysteem. De aangeboren immuunrespons kan duiden op gevoeligheid voor infectie. Macrophage cellijnen worden veel gebruikt in studies van de immunologie. Echter, de uitgebreide passage kan gene verlies en immuun functies in deze cellijnen in gevaar gebracht. De primaire peritoneale macrofagen zijn dus het ideale object in waarnaar u de cel functie1studie.
Hoewel de aangeboren immuunrespons gedacht intact in het jaar oud lichaam dat werd, kan de fagocytische vermogen afnemen in vergelijking met dat in de jongere lichaam2,3. Hier zullen we laten zien dat een methode voor de beoordeling van de fagocytose van peritoneale macrofagen van jonge (acht weken oude) en ouderen (16-maand-oude) muis met behulp van EGFP-uiten E. coli, die handig, snel en economisch haalbaar is is.
Het gebruik van een uiting van EGFP E. coli stam is een van de voordelen van deze test omdat deze bacteriën stabiel zijn en een sterke fluorescentie-signaal, zelfs nadat macrofagen worden opgelost door 4% (m/v) paraformaldehyde weergegeven. Bovendien, met behulp van de uiting van EGFP E. coli, onderzoekers hoeft niet verder kleuring na fagocytose, wat tijd bespaart. Bovendien zijn de macrofagen immunoresponsive voor E. coli oppervlakte-antigeen, meer geschikt voor de fagocytose assay dan het gebruik van het uiten van EGFP schimmels of fluoresceïne-geëtiketteerden kralen maken van E. coli .
Met uiten van EGFP E. coli, kan een fagocytose assay gemakkelijk worden bereikt in 2 h en gemeten door beide stroom cytometry en fluorescentie microscopie, afhankelijk van het doel van de onderzoeker. Aangezien deze methode direct de fagocytische mogelijkheid meet, zijn de resultaten meer reproduceerbare dan andere indirecte methoden.
Deze methode is ook gevalideerd in een cellijn van RAW264.7 en perifere bloed mononucleaire cellen4. Onderstaande tekst de gedetailleerde stapsgewijze instructies voor het uitvoeren van deze test en benadrukt de essentiële stappen die de onderzoekers wijzigen kunnen om te voldoen aan de behoeften van hun experimenten.
Protocol
Representative Results
Discussion
De stappen in dit protocol zijn vrij eenvoudig en duidelijk. Een van de kritische stappen is voor het opwekken van de expressie van EGFP op E. coli. Meestal, wanneer een gen van eukaryoten, zoals EGFP, is gepland om uit te drukken in prokaryoten zoals E. coli, is er een risico dat het eiwit zal vormen inactief aggregaten (opneming lichamen), waardoor de oorspronkelijke structuur en de activiteit van het eiwit is gewijzigd. Met behulp van het huisdier-SUMO vector en bouw van het huisdier-SUMO-EGFP plasmi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (nr. 31800046) en de Natural Science Foundation van Liaoning Province (nr. 20170540262). Dit werk werd gerealiseerd in de laboratoria van het Scientific Research Center aan de tweede ziekenhuis van Dalian medische universiteit. De auteurs bedank Xiao-Lin Sang voor haar hulp bij de stroom cytometry, en Bo Qu en Dong-Chuan Yang voor hun hulp bij het opstellen van de video.
Materials
| BD FACSCanto II Flow cytometer | BD Biosciences | – | |
| Biotin anti-mouse CD16/32 Antibody | Biolegend | Cat101303 | |
| Champion pET SUMO Protein Expression system | Invitrogen | K300-01 | |
| Custom Gene Synthesis Service | Takara Biotech. | – | |
| DAPI(4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher | D1306 | |
| F4/80-PE anti-mouse antibody for FACS | Biolegend | Cat123110 | |
| Leica DMI3000 B Inverted Microscope | Leica Microsystems | – | |
| PE Rat IgG2a, κ-isotype control | Biolegend | Cat400507 | |
| Phalloidin 633 fluorescence dye conjugated working solution | AAT Bioquest | Cat23125 | |
| Thioglycollate medium | Sigma-Aldrich | T9032 |
References
- Layoun, A., Samba, M., Santos, M. M. Isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation. Journal of Visualized Experiments. 98, e52749 (2015).
- Iskander, K. N., et al. Sepsis: multiple abnormalities, heterogeneous responses, and evolving understanding. Physiological Reviews. 93 (3), 1247-1288 (2013).
- Girard, T. D., Opal, S. M., Ely, E. W. Insights into severe sepsis in older patients: from epidemiology to evidence-based management. Clinical Infectious Diseases. 40 (5), 719-727 (2005).
- Bicker, H., et al. A simple assay to measure phagocytosis of live bacteria. Clinical Chemistry. 54 (5), 911-915 (2008).
- Zhou, M. Y., Gomez-Sanchez, C. E. Universal TA cloning. Current Issues in Molecular Biology. 2 (1), 1-7 (2000).
- Chen, Q., et al. Triggering receptor expressed on myeloid cells-2 protects against polymicrobial sepsis by enhancing bacterial clearance. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (2), 201-212 (2013).
- Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. Isolation of Macrophage Early and Late Endosomes by Latex Bead Internalization and Density Gradient Centrifugation. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2015).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
- Weingart, C. L., et al. Fluorescent labels influence phagocytosis of Bordetella pertussis by human neutrophils. Infection and Immunity. 67 (8), 4264-4267 (1999).
- Neaga, A., Lefor, J., Lich, K. E., Liparoto, S. F., Xiao, Y. Q. Development and validation of a flow cytometric method to evaluate phagocytosis of pHrodo BioParticles(R) by granulocytes in multiple species. Journal of Immunological Methods. 390 (1-2), 9-17 (2013).
- Ninkovic, J., Roy, S. High throughput fluorometric technique for assessment of macrophage phagocytosis and actin polymerization. Journal of Visualized Experiments. (93), e52195 (2014).
