用化学干燥进行扫描电镜 (sem) 形态分析的原核生物和真核生物的制备
Summary
扫描电镜分析是帮助物种鉴定或表型鉴别的有效方法。该协议描述了检查三种具有代表性的生物体的具体形态细节的方法, 并将广泛适用于检查许多组织和组织类型的特征。
Abstract
扫描电子显微镜 (sem) 是一种广泛使用的技术, 已被应用于研究生物标本, 从单个蛋白质到细胞, 组织, 细胞器, 甚至整个生物体。该协议侧重于两种化学干燥方法, 六甲基二硅烷 (hmds) 和 t-丁醇 (tba), 及其在原核生物和真核生物的成像使用 sem。在这篇文章中, 我们描述了如何固定, 洗涤, 脱水, 干燥, 安装, 溅射外套, 和图像三种类型的生物体: 蓝藻(toxifilum mysicida, golenkina sp., 和一个未知的 sp), 两种黄酮类化合物属单诺莫诺莫莫莫莫尼卡(金银花和假花蝇) 和果蝇 (果蝇)。本协议的目的是描述一种快速、廉价和简单的方法, 以获取有关样品的结构、大小和表面特性的详细信息, 这些信息可广泛应用于大量生物的形态评估。成功完成此协议将允许其他人使用 sem 通过将这些技术应用于他们的系统来可视化样本。
Introduction
扫描电子显微镜 (sem) 使用高能电子的聚焦束从二次电子中生成显示样本1的形态和地形的图像。sem 可用于直接确定样品的物理尺寸、表面结构和三维形状, 并提供更大的分辨率和更大的景深相比, 光显微镜。另一种形式的电子显微镜 (em), 透射电子显微镜 (tem) 使用聚焦电子通过样品, 产生图像与内部结构的细节。虽然 tem 的分辨率高于光或 sem, 可用于解析单个原子这样小的结构, 但它有三个主要缺点: 广泛的样品制备、一个小的视野和一个浅景深 2,3。虽然其他可视化协议存在使用 sem 来检查特定的细胞, 细胞器,或组织4,5,6, 7, 8,9,10 、该协议的独特之处在于, 我们描述了可广泛应用于大量生物进行形态评估的方法。
sem 在研究无机材料方面有着广泛的应用, 包括纳米粒子11、12、聚合物13,以及在地质、工业和材料科学14 中的众多应用. 15,16。在生物学中, sem 长期以来一直被用作检测从单个蛋白质到整个生物体的生物样本的方法 17,18。扫描电镜具有特殊的价值, 因为形态表面细节可以用来为科学发现提供信息。sem 分析是一种快速、廉价、简单的方法, 可以获得关于各种生物样品的结构、大小和表面特性的详细信息。
由于 sem 通常在高真空 (10-6 torr 最小值) 下工作, 以支持高速电子的相干束, 因此样品室中不允许使用液体 (水、油、醇), 因为液体可防止真空形成。因此, 使用 sem 检测的所有样品都必须脱水, 通常使用分级乙醇系列, 然后采用干燥过程来去除乙醇。有几种方法来干燥生物组织用于扫描电镜, 包括空气干燥, 冻干, 使用临界点干燥 (cpd) 装置, 或使用 t-丁醇 (tba) 或六甲基二硅烷 (hmds)化学干燥19,20,21,22. 大多数情况下, 选择干燥方法是经验性的, 因为每个生物样本对每个干燥方法的反应可能不同。对于任何给定的示例, 所有这些方法都可能是适当的, 因此比较每种方法的优缺点对于选择适当的方法很有用。
虽然在室温或干燥炉 (60°c) 下空气干燥样品是最简单的方法, 但大多数生物样品显示干燥引起的损伤, 如枯萎和塌陷, 导致样品变形。冷冻干燥的过程也会去除样品中的水 (或冰), 但需要将样品进行闪存冷冻,并置于真空下, 通过升华过程去除冰, 从而有可能对样品造成损害。此外, 用户必须有权访问冻干机。sem 脱水样品最常用的方法是临界点干燥 (cpd)。在 cpd 中, 样品中的乙醇被液体二氧化碳 (co2) 所取代, 在被称为临界点的特定温度和压力条件下 (31.1°c 和 1, 073 psi), co2在不产生表面张力的情况下蒸发, 从而产生表面张力, 从而有效地保持样品的形态和结构特征。虽然 cpd 通常是标准方法, 但它有几个缺点。首先, 这一过程需要使用临界点干燥器, 这不仅昂贵, 而且还需要使用液体二氧化碳。其次, 可以干燥的样品的大小仅限于临界点干燥机的腔体大小。第三, 在 cpd 过程中液体的交换会导致湍流, 从而损坏样品。
与 cpd 相比, 化学干燥具有许多优势, 并可作为一种合适的替代品, 在 sem 样品制备中得到广泛应用。使用 tba 和 hmds 等化学脱水剂为其他方法提供了快速、廉价和简单的替代方法, 同时仍然保持样品的结构完整性。我们最近发现, 在成人嗜酸性视网膜组织23中使用 cpd 或 tba 作为干燥方法时, 组织的完整性或最终图像的质量没有差异.与 cpd 不同, tba 和 hmds 不需要干燥仪器或液体co2 , 也不限制要干燥的样品的大小。除了获得这些化学品外, 完成干燥过程只需标准的化学烟罩和适当的个人防护设备 (手套、实验室涂层和安全护目镜) 即可完成。虽然 tba 和 hmds 都是易燃的, 但 tba 的毒性和成本都比 hmds 低, 成本也更低 (约为 hmds 成本的 1.5倍)。
在这篇文章中, 我们描述了如何固定, 洗涤, 脱水, 干燥, 安装, 溅射外套, 和图像三种类型的生物体: 蓝藻(toxifilum mysicida, golenkina sp., 和一个未知的 sp), 两种黄酮类化合物属单诺莫诺莫莫莫莫尼卡(金银花和假花蝇) 和果蝇 (果蝇)。这些生物体的大小 (0.5μm 至4毫米) 和细胞多样性 (单细胞到多细胞) 范围很广, 但所有生物体都很容易适应 sem 分析, 只需进行样品制备所需的微小变化。该协议描述了使用化学脱水和扫描电镜分析来检查三种生物的形态细节的方法, 并将广泛适用于检查许多组织和组织类型。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这里, 我们描述了一个协议使用 sem 来获取有关三种生物的外部形态特征的详细信息, 其他生物可以应用于检查许多类型的生物体或组织的特征。在协议的每个步骤中, 都可能出现潜在的误差点, 下文将对此进行详细讨论。
虽然这里给出的固定和洗涤量是具体的, 但一般来说, 固定和洗涤的体积应该是样品体积的5-10x。所有的固定、清洗和脱水时间都是基于我们的经验, 如果出?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作的资金来自中央密歇根大学研究和研究生办公室对 mls 的资助和对 mak 的暑期学者奖。蓝藻是由 zimba 和浮游生物实验室提供的, 该实验室是德克萨斯 a & m 大学科珀斯克里斯蒂海岸研究中心的一部分。优化子碱是由密歇根州立大学的 triemer 实验室提供的。
Materials
| gold–palladium | Ted Pella, Inc. | 91212 | |
| Silver conductive adhesive 503 | Electron Microscopy Sciences | 12686-15 | |
| Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 8 μm, polycarbonate | Sigma | WHA110614 | |
| Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.8 μm, polycarbonate, black | Sigma | WHA110659 | |
| Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.2 μm, polycarbonate | Sigma | WHA110606 | |
| aluminum weighing dish | Fisher Scientific | 08-732-100 | |
| aluminum mounting stubs (12 mm) | Electron Microscopy Sciences | 75210 | |
| aluminum mounting stubs (25 mm) | Electron Microscopy Sciences | 75186 | |
| Adhesive tabs | Electron Microscopy Sciences | 76760 | |
| conductive carbon adhesive tabs | Electron Microscopy Sciences | 77825 | |
| F/2 media | Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin | https://utex.org/products/f_2-medium | No Catalog number given – see link |
| AF6 media | Bigelow – National Center for Marin Algae and Microbiota | https://ncma.bigelow.org/media/wysiwyg/Algal_recipes/NCMA_algal_medium_AF6_1.pdf | No Catalog number given – see link |
| Soil water medium | Carolina Biological Supply Company | 153785 | |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100) | VWR | 97062-208 | |
| Hummer 6.2 Sputter Coater | Anatech USA | http://www.anatechusa.com/hummer-sputter-systems/4 | No Catalog number given – see link |
| Hitachi 3400N-II SEM | Hitachi | https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/?ld=sms2&md=sms2-1&sd=sms2-1-2&gclid=EAIaIQobChMIpq_jtJfj3AIVS7jACh2mdgkPEAAYASAAEgKAnfD_BwE | The company doesn't appear to sell this model any longer |
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