Summary

Выделение и характеристика человека пуповины производные мезенхимальных стволовых клеток из доношенных и недоношенных новорожденных

Published: January 26, 2019
doi:

Summary

Пуповина человека (UC) могут быть получены в течение перинатального периода в результате преждевременных, термин и postterm доставки. В этом протоколе мы описываем изоляции и характеристика UC-производные мезенхимальных стволовых клеток (UC-МСК) из плодов/младенцев на 19-40 недель гестации.

Abstract

Мезенхимальных стволовых клеток (МСК) имеют значительный терапевтический потенциал и привлечь все больший интерес в области биомедицины. MSCs первоначально изолирован и характеризуется из костного мозга (БМ), то приобрел от тканей, включая жировой ткани, синовиальной оболочки, кожи, пульпы зуба и плода придатки как плаценты, пуповины кровь (УКБ) и пуповины (UC). MSCs являются популяции гетерогенных клеток с емкостью для (1) соблюдения пластик в условиях стандартной культуры, (2) поверхность маркер выражения CD73+/CD90+/CD105+/CD45 /CD34/CD14/CD19 /HLA-DR фенотипов и (3) trilineage дифференцировку в адипоциты, остеоциты и хрящевые клетки, как в настоящее время определяется международным обществом клеточной терапии (ИКСТ). Хотя BM является наиболее широко используемым источником MSCs, захватнический характер стремления BM этически ограничивает его доступность. Пролиферации и дифференцировки потенциала MSCs полученные от БМ в целом снижение с возрастом донора. В отличие от плода MSCs, полученные из UC имеют преимущества как энергичный распространения и дифференциации потенциал. Существует без этических озабоченность для UC выборки, как она обычно рассматривается как медицинские отходы. Человека UC начинает развиваться с продолжающийся рост амниотической полости в 4-8 недель гестации и продолжает расти до достижения 50-60 см в длину, и это может быть изолированы в период всей новорожденных доставки. Чтобы разобраться в патофизиологии сложных заболеваний, мы использовали UC-производные MSCs (UC-MSCs) от младенцев, роды на различных сроках гестации. В этом протоколе мы описываем, изоляции и характеристика UC-MSCs из плодов/младенцев в 19-40 недель гестации.

Introduction

Мезенхимальных стволовых клеток (МСК) первоначально изолированы и характеризуется из костного мозга (БМ)1,2 , но также можно получить из различных тканей, включая жировой ткани, синовиальной оболочки, кожи, пульпы зуба и плода придатков 3. MSCs признаны популяции гетерогенных клеток, которые могут размножаться и дифференцироваться в адипоциты, остеоциты и хондроцитов. Кроме того, MSCs обладают способностью перейти на сайты травмы, подавлять и модуляции иммунного ответа, переделывать и ремонт повреждений. В настоящее время MSCs из разных источников привлекали растущий интерес как источник для клеточной терапии против целого ряда сложных заболеваний, включая трансплантат – versus – хост болезнь, инфаркт миокарда и ишемии миокарда4,5 .

Хотя BM является наиболее хорошо изученных источником MSCs, инвазивность BM аспирации этически ограничивает его доступность. Пролиферации и дифференцировки потенциала MSCs полученные от БМ в целом снижение с возрастом донора. В отличие от плода MSCs полученные от плода придатки как плаценты, пуповины кровь (УКБ), и пуповины (UC) имеют преимущества, включая менее этические соображения относительно отбора проб и надежное распространение и дифференциации потенциал6 , 7. среди плода придатки, которые обычно удаляются как медицинские отходы, UCB и UC считаются плода орган, в то время как плацента считается fetomaternal. Кроме того плаценты и UCB необходимо пробы и собранных в точный момент новорожденных доставки, тогда как плаценты и UC могут быть собраны и обработаны после родов новорожденных. Соответственно UC является многообещающим источником MSC для клетки терапии8,9.

Человека UC начинает развиваться с прогрессивной расширения амниотической полости в 4-8 недель гестации, продолжает расти до 50-60 см в длину и могут быть изолированы в течение всего периода новорожденного доставки10. Чтобы разобраться в патофизиологии сложных заболеваний, мы используем UC-производные MSCs (UC-MSCs) от младенцев, роды в различных сроках гестации11,12. В этом протоколе мы опишем, как изолировать и характеризуют UC-MSCs из плодов/младенцев в 19-40 недель гестации.

Protocol

Использование человеческой образцы для этого исследования был одобрен этическим Комитетом Кобе выпускник школы медицины университета (утверждение № 1370 и 1694) и в соответствии с утвержденными руководящими принципами. 1. изоляция и культура UC-МСК Примеч?…

Representative Results

Процедуры из коллекции UC MSC культуре резюмируются в рисунке 1. UC приблизительно 5-10 см в длину могут быть собраны из всех новорожденных, доставлено путем операции кесарева сечения. UC начинает развиваться в 4-8 недель гестации и продолжает расти до 50-60 см в ?…

Discussion

MSCs могут быть изолированы от различных тканей и являются гетерогенной популяция клеток, которые не все Экспресс же фенотипические маркеры. Здесь мы изложили протокол, который проведет сбор и рассечение UC от преждевременных и срочных младенцев и позволяет изоляции и культуры UC-MSCs. Посл?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана дотаций для Scientific Research (C) (номер гранта: 25461644) и молодых ученых (B) (предоставление номера: 15 K 19614, 26860845, 17 K 16298) из JSP-страницы KAKENHI.

Materials

50mL plastic tube AS One Coporation, Osaka, Japan Violamo 1-3500-22
12-well plate AGC Techno Glass, Tokyo, Japan Iwaki 3815-012
60mm dish AGC Techno Glass, Tokyo, Japan Iwaki 3010-060
Cell strainer (100 μm) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA  Falcon 35-2360
Cell strainer (70 μm) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA  Falcon 35-2350
Alpha MEM Wako Pure Chemical, Osaka, Japan 135-15175
Fetal bovine serum Sigma Aldrich, St. Louis, MO 172012
Reduced serum medium Thermo Fisher Scientific, waltham, MA OPTI-MEM Gibco 31985-070
Antibiotic-antimycotic Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA  Gibco 15240-062
Trypsin-EDTA Wako Pure Chemical, Osaka, Japan 209-16941
PBS Takara BIO, Shiga,Japan T900
Purified enzyme blends Roche, Mannheim, Germany Liberase DH Research Grade 05401054001
PE-conjugated mouse primary antibody against CD14 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 347497 Lot: 3220644, RRID: AB_400312
PE-conjugated mouse primary antibody against CD19 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 340364 Lot: 3198741, RRID: AB_400018
PE-conjugated mouse primary antibody against CD34 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555822 Lot: 3079912, RRID: AB_396151
PE-conjugated mouse primary antibody against CD45 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555483 Lot: 2300520, RRID: AB_395875
PE-conjugated mouse primary antibody against CD73 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 550257 Lot: 3057778, RRID: AB_393561
PE-conjugated mouse primary antibody against CD90 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555596 Lot: 3128616, RRID: AB_395970
PE-conjugated mouse primary antibody against CD105 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 560839 Lot: 4339624, RRID: AB_2033932
PE-conjugated mouse primary antibody against HLA-DR BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 347367 Lot: 3219843, RRID: AB_400293
PE-conjugated mouse IgG1 k isotype BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555749 Lot: 3046675, RRID: AB_396091
PE-conjugated mouse IgG2a k isotype BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555574 Lot: 3035934, RRID: AB_395953
PE-conjugated mouse IgG2b k isotype BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555743 Lot: 3098896, RRID: AB_396086
Viability dye BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ Fixable Viability Stain 450 562247
Blocking reagent Dainippon Pharmaceutical, Osaka, Japan Block Ace UKB80
FCM BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ BD FACSAria  III Cell Sorter
FCM software BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ BD FACSDiva
Adipogenic differentiation medium Invitrogen, Carlsbad, CA StemPro Adipogenesis Differentiation kit A10070-01
Osteogenic differentiation medium Invitrogen, Carlsbad, CA StemPro Osteogenesis Differentiation kit A10072-01
Chondrogenic differentiation medium  Invitrogen, Carlsbad, CA StemPro Chondrogenesis Differentiation kit A10071-01
Formaldehyde Polyscience, Warrigton, PA 16% UltraPure Formaldehyde EM Grade #18814
Oil Red O Sigma Aldrich, St. Louis, MO O0625
Arizarin Red S Sigma Aldrich, St. Louis, MO A5533
Toluidine Blue Sigma Aldrich, St. Louis, MO 198161
Microscope Keyence, Osaka, Japan BZ-X700

References

  1. Friedenstein, A. J., Petrakova, K. V., Kurolesova, A. I., Frolova, G. P. Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues. Transplantation. 6 (2), 230-247 (1968).
  2. Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells. Journal of Orthopaedic Research. 9 (5), 641-650 (1991).
  3. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
  4. Bianco, P., Robey, P. G., Simmons, P. J. Mesenchymal Stem Cells: Revisiting History, Concepts, and Assays. Cell Stem Cell. 2 (4), 313-319 (2008).
  5. Bianco, P. 34;Mesenchymal" stem cells. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 677-704 (2014).
  6. Baksh, D., Yao, R., Tuan, R. S. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow. Stem Cells. 25 (6), 1384-1392 (2007).
  7. Manochantr, S., et al. Immunosuppressive properties of mesenchymal stromal cells derived from amnion, placenta, Wharton’s jelly and umbilical cord. Internal Medicine Journal. 43 (4), 430-439 (2013).
  8. Arutyunyan, I., et al. Umbilical Cord as Prospective Source for Mesenchymal Stem Cell-Based Therapy. Stem Cells International. 6901286, (2016).
  9. Davies, J. E., Walker, J. T., Keating, A. Concise Review: Wharton’s Jelly: The Rich, but Enigmatic, Source of Mesenchymal Stromal Cells. Stem Cells Translational Medicine. 6 (7), 1620-1630 (2017).
  10. Zhu, D., Wallace, E. M., Lim, R. Cell-based therapies for the preterm infant. Cytotherapy. 16 (12), 1614-1628 (2014).
  11. Iwatani, S., et al. Gestational Age-Dependent Increase of Survival Motor Neuron Protein in Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells. Frontiers in Pediatrics. 5, 194 (2017).
  12. Iwatani, S., et al. Involvement of WNT Signaling in the Regulation of Gestational Age-Dependent Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cell Proliferation. Stem Cells International. , 8749751 (2017).
  13. Mennan, C., et al. Isolation and characterisation of mesenchymal stem cells from different regions of the human umbilical cord. BioMed Research International. 916136, (2013).
  14. Capelli, C., et al. Minimally manipulated whole human umbilical cord is a rich source of clinical-grade human mesenchymal stromal cells expanded in human platelet lysate. Cytotherapy. 13 (7), 786-801 (2011).
  15. Lu, L. L., et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials. Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).
  16. Tong, C. K., et al. Generation of mesenchymal stem cell from human umbilical cord tissue using a combination enzymatic and mechanical disassociation method. Cell Biology International. 35 (3), 221-226 (2011).
  17. Han, Y. F., et al. Optimization of human umbilical cord mesenchymal stem cell isolation and culture methods. Cytotechnology. 65 (5), 819-827 (2013).
  18. Paladino, F. V., Peixoto-Cruz, J. S., Santacruz-Perez, C., Goldberg, A. C. Comparison between isolation protocols highlights intrinsic variability of human umbilical cord mesenchymal cells. Cell Tissue Bank. 17 (1), 123-136 (2016).
  19. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  20. Mareschi, K., et al. Expansion of mesenchymal stem cells isolated from pediatric and adult donor bone marrow. Journal of Cellular Biochemistry. 97 (4), 744-754 (2006).
  21. Choumerianou, D. M., et al. Comparative study of stemness characteristics of mesenchymal cells from bone marrow of children and adults. Cytotherapy. 12 (7), 881-887 (2010).
  22. Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells and Development. 22 (17), 2425-2439 (2013).

Play Video

Cite This Article
Iwatani, S., Yoshida, M., Yamana, K., Kurokawa, D., Kuroda, J., Thwin, K. K. M., Uemura, S., Takafuji, S., Nino, N., Koda, T., Mizobuchi, M., Nishiyama, M., Fujioka, K., Nagase, H., Morioka, I., Iijima, K., Nishimura, N. Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants. J. Vis. Exp. (143), e58806, doi:10.3791/58806 (2019).

View Video