Isolering og karakterisering af menneskelige navlestrengen-afledte mesenkymale stamceller fra præmature og fødte spædbørn
Summary
Menneskelige navlestrengen (UC) kan fås i den perinatale periode som følge af præmature, sigt og postterm levering. I denne protokol beskriver vi isolering og karakterisering af UC-afledte mesenkymale stamceller (UC-MSCs) fra fostre/spædbørn på 19-40 uger af drægtigheden.
Abstract
Mesenchymale stamceller (msc) har betydelige terapeutiske potentiale og tiltrække voksende interesse for det biomedicinske område. MSC’er er oprindeligt isoleret og karakteriseret fra knoglemarv (BM), så erhvervet fra væv, herunder fedtvæv, synovium, hud, dental pulp og føtal vedhæng som moderkagen, navlestrengsblod (UCB) og navlestrengen (UC). MSC’er er en heterogen celle population med kapacitet for (1) overholdelse af plast i standard dyrkningsbetingelser, (2) overflade markør udtryk for CD73+/CD90+/CD105+/CD45–/CD34–/CD14–/CD19 –/HLA-DR– fænotyper, og (3) trilineage differentiering adipocytter, osteocytes og chondrocytter, som i øjeblikket er defineret af International Society for cellulære terapi (ISCT). Selvom BM er den mest udbredte kilde til MSC’er, begrænser den invasive art af BM aspiration etisk dens tilgængelighed. Spredning og differentiering kapacitet af MSCs fremstillet af BM generelt forringes med alderen af donor. Derimod har føtal MSCs fremstillet af UC fordele såsom kraftige spredning og differentiering kapacitet. Der er ingen etiske bekymring for UC prøveudtagning, som det er typisk betragtes som medicinsk affald. Menneskelige UC begynder at udvikle med fortsat vækst af fostervand hulrummet på 4-8 uger af drægtighedsperioden og holder vokser indtil nå 50-60 cm i længden, og det kan isoleres i den hele nyfødte leveringsperiode. For at få indsigt i Patofysiologi af genstridig sygdomme, har vi brugt UC-afledte MSCs (UC-MSCs) fra spædbørn leveret på forskellige svangerskabsuge aldre. I denne protokol beskriver vi isolering og karakterisering af UC-MSCs fra fostre/spædbørn på 19-40 uger af drægtigheden.
Introduction
Mesenchymale stamceller (msc) er oprindeligt isoleret og karakteriseret fra knoglemarv (BM)1,2 , men kan også fås fra en bred vifte af væv, herunder fedtvæv, synovium, hud, dental pulp og føtal vedhæng 3. MSCs er anerkendt som en heterogen celle population, der kan formere sig og differentiere i adipocytter, osteocytes og chondrocytter. Derudover MSCs besidder evnen til at overflytte til steder af skade, undertrykke og modulere immunrespons, ombygge og reparere skaden. I øjeblikket MSCs fra forskellige kilder har tiltrukket sig stigende interesse som en kilde til celleterapi mod en række genstridig sygdomme, herunder graft – versus klovesyge vært, myokardieinfarkt og cerebral infarkt4,5 .
Selvom BM er den mest godt karakteriseret kilde af MSC’er, begrænser invasionsevne af BM aspiration etisk dens tilgængelighed. Spredning og differentiering kapacitet af MSCs fremstillet af BM generelt forringes med alderen af donor. Derimod føtal MSCs fremstillet af føtal vedhæng som moderkagen, navlestrengsblod (UCB), og navlestrengen (UC) har fordele, herunder mindre etiske bekymringer med hensyn til prøveudtagning og robust spredning og differentiering kapacitet6 , 7. blandt føtal vedhæng, der som regel kasseres som medicinsk affald, UCB og UC betragtes en føtal orgel, mens placenta anses for fetomaternal. Derudover skal moderkagen og UCB stikprøven og indsamlet på det nøjagtige tidspunkt for nyfødte levering, der henviser til, at moderkagen og UC kan indsamles og behandles efter nyfødte levering. UC er derfor en lovende MSC-kilde til celle terapi8,9.
Menneskelige UC begynder at udvikle med gradvis udvidelse af fostervand hulrummet på 4-8 uger af drægtigheden, fortsætter med at vokse indtil 50-60 cm i længden og kan isoleres i hele perioden af nyfødte levering10. For at få indsigt i Patofysiologi af genstridig sygdomme, bruger vi UC-afledte MSCs (UC-MSCs) fra spædbørn leveret på forskellige svangerskabsuge aldre11,12. I denne protokol beskriver vi hvordan man isolerer og karakteriserer UC-MSCs fra fostre/spædbørn på 19-40 uger af drægtigheden.
Protocol
Representative Results
Discussion
MSC’er kan isoleres fra en række forskellige væv og er heterogene befolkning af celler, der gør ikke alle express de samme fænotypiske markører. Her, skitseret vi en protokol, der guider indsamling og dissektion af UC fra præmature og udtrykket spædbørn og muliggør isolation og kultur af UC-MSCs. Efter denne protokol, har vi med succes isoleret UC-MSC’er, der opfylder ISCT kriterier19 fra fostre/spædbørn leveret på 19-40 uger af drægtigheden og demonstreret, at de repræsenterer nogle…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Grants-in-Aid for Scientific Research (C) (giver nummer: 25461644) og unge forskere (B) (tildele numre: 15 K 19614, 26860845, 17 K 16298) af JSPS KAKENHI.
Materials
| 50mL plastic tube | AS One Coporation, Osaka, Japan | Violamo 1-3500-22 | |
| 12-well plate | AGC Techno Glass, Tokyo, Japan | Iwaki 3815-012 | |
| 60mm dish | AGC Techno Glass, Tokyo, Japan | Iwaki 3010-060 | |
| Cell strainer (100 μm) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Falcon 35-2360 | |
| Cell strainer (70 μm) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Falcon 35-2350 | |
| Alpha MEM | Wako Pure Chemical, Osaka, Japan | 135-15175 | |
| Fetal bovine serum | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | 172012 | |
| Reduced serum medium | Thermo Fisher Scientific, waltham, MA | OPTI-MEM Gibco 31985-070 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Gibco 15240-062 | |
| Trypsin-EDTA | Wako Pure Chemical, Osaka, Japan | 209-16941 | |
| PBS | Takara BIO, Shiga,Japan | T900 | |
| Purified enzyme blends | Roche, Mannheim, Germany | Liberase DH Research Grade 05401054001 | |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD14 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 347497 | Lot: 3220644, RRID: AB_400312 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD19 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 340364 | Lot: 3198741, RRID: AB_400018 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD34 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555822 | Lot: 3079912, RRID: AB_396151 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD45 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555483 | Lot: 2300520, RRID: AB_395875 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD73 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 550257 | Lot: 3057778, RRID: AB_393561 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD90 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555596 | Lot: 3128616, RRID: AB_395970 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD105 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 560839 | Lot: 4339624, RRID: AB_2033932 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against HLA-DR | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 347367 | Lot: 3219843, RRID: AB_400293 |
| PE-conjugated mouse IgG1 k isotype | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555749 | Lot: 3046675, RRID: AB_396091 |
| PE-conjugated mouse IgG2a k isotype | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555574 | Lot: 3035934, RRID: AB_395953 |
| PE-conjugated mouse IgG2b k isotype | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555743 | Lot: 3098896, RRID: AB_396086 |
| Viability dye | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | Fixable Viability Stain 450 562247 | |
| Blocking reagent | Dainippon Pharmaceutical, Osaka, Japan | Block Ace UKB80 | |
| FCM | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | BD FACSAria III Cell Sorter | |
| FCM software | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | BD FACSDiva | |
| Adipogenic differentiation medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | StemPro Adipogenesis Differentiation kit A10070-01 | |
| Osteogenic differentiation medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | StemPro Osteogenesis Differentiation kit A10072-01 | |
| Chondrogenic differentiation medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | StemPro Chondrogenesis Differentiation kit A10071-01 | |
| Formaldehyde | Polyscience, Warrigton, PA | 16% UltraPure Formaldehyde EM Grade #18814 | |
| Oil Red O | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | O0625 | |
| Arizarin Red S | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | A5533 | |
| Toluidine Blue | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | 198161 | |
| Microscope | Keyence, Osaka, Japan | BZ-X700 |
References
- Friedenstein, A. J., Petrakova, K. V., Kurolesova, A. I., Frolova, G. P. Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues. Transplantation. 6 (2), 230-247 (1968).
- Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells. Journal of Orthopaedic Research. 9 (5), 641-650 (1991).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
- Bianco, P., Robey, P. G., Simmons, P. J. Mesenchymal Stem Cells: Revisiting History, Concepts, and Assays. Cell Stem Cell. 2 (4), 313-319 (2008).
- Bianco, P. 34;Mesenchymal" stem cells. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 677-704 (2014).
- Baksh, D., Yao, R., Tuan, R. S. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow. Stem Cells. 25 (6), 1384-1392 (2007).
- Manochantr, S., et al. Immunosuppressive properties of mesenchymal stromal cells derived from amnion, placenta, Wharton’s jelly and umbilical cord. Internal Medicine Journal. 43 (4), 430-439 (2013).
- Arutyunyan, I., et al. Umbilical Cord as Prospective Source for Mesenchymal Stem Cell-Based Therapy. Stem Cells International. 6901286, (2016).
- Davies, J. E., Walker, J. T., Keating, A. Concise Review: Wharton’s Jelly: The Rich, but Enigmatic, Source of Mesenchymal Stromal Cells. Stem Cells Translational Medicine. 6 (7), 1620-1630 (2017).
- Zhu, D., Wallace, E. M., Lim, R. Cell-based therapies for the preterm infant. Cytotherapy. 16 (12), 1614-1628 (2014).
- Iwatani, S., et al. Gestational Age-Dependent Increase of Survival Motor Neuron Protein in Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells. Frontiers in Pediatrics. 5, 194 (2017).
- Iwatani, S., et al. Involvement of WNT Signaling in the Regulation of Gestational Age-Dependent Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cell Proliferation. Stem Cells International. , 8749751 (2017).
- Mennan, C., et al. Isolation and characterisation of mesenchymal stem cells from different regions of the human umbilical cord. BioMed Research International. 916136, (2013).
- Capelli, C., et al. Minimally manipulated whole human umbilical cord is a rich source of clinical-grade human mesenchymal stromal cells expanded in human platelet lysate. Cytotherapy. 13 (7), 786-801 (2011).
- Lu, L. L., et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials. Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).
- Tong, C. K., et al. Generation of mesenchymal stem cell from human umbilical cord tissue using a combination enzymatic and mechanical disassociation method. Cell Biology International. 35 (3), 221-226 (2011).
- Han, Y. F., et al. Optimization of human umbilical cord mesenchymal stem cell isolation and culture methods. Cytotechnology. 65 (5), 819-827 (2013).
- Paladino, F. V., Peixoto-Cruz, J. S., Santacruz-Perez, C., Goldberg, A. C. Comparison between isolation protocols highlights intrinsic variability of human umbilical cord mesenchymal cells. Cell Tissue Bank. 17 (1), 123-136 (2016).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Mareschi, K., et al. Expansion of mesenchymal stem cells isolated from pediatric and adult donor bone marrow. Journal of Cellular Biochemistry. 97 (4), 744-754 (2006).
- Choumerianou, D. M., et al. Comparative study of stemness characteristics of mesenchymal cells from bone marrow of children and adults. Cytotherapy. 12 (7), 881-887 (2010).
- Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells and Development. 22 (17), 2425-2439 (2013).
