अलगाव और मानव गर्भनाल के लक्षण वर्णन-व्युत्पंन Mesenchymal और अवधि के शिशुओं से स्टेम सेल
Summary
मानव गर्भनाल (यूसी) प्रसवकालीन अवधि के दौरान प्राप्त किया जा सकता है, शब्द का एक परिणाम के रूप में, और postterm वितरण । इस प्रोटोकॉल में, हम अलगाव और के लक्षण वर्णन UC-व्युत्पन्न mesenchymal स्टेम सेल (UC-MSCs) भ्रूणों/शिशुओं से 19-40 सप्ताह के गर्भ में ।
Abstract
Mesenchymal स्टेम सेल (MSCs) काफी चिकित्सीय क्षमता है और जैव चिकित्सा के क्षेत्र में रुचि बढ़ाने को आकर्षित । MSCs मूल रूप से अलग कर रहे है और अस्थि मज्जा (बी एम) से विशेषता है, तो वसा ऊतक, synovium, त्वचा, दंत लुगदी, और नाल, गर्भनाल रक्त (यूसीबी), और गर्भनाल (यूसी) के रूप में भ्रूण उपांग सहित ऊतकों से हासिल की । MSCs के लिए क्षमता के साथ एक विषम कोशिका आबादी है (1) मानक संस्कृति की स्थिति में प्लास्टिक का पालन, (2) CD73 की सतह मार्कर अभिव्यक्ति+/CD90+/CD105+/CD45-/CD34-/CD14-/CD19 –/HLA-DR– phenotypes, और (3) adipocytes, osteocytes, और chondrocytes में trilineage भेदभाव, वर्तमान में सेलुलर थेरेपी (ISCT) के लिए इंटरनेशनल सोसायटी द्वारा परिभाषित के रूप में । हालांकि बीएम MSCs के सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया स्रोत है, बीएम आकांक्षा के इनवेसिव प्रकृति नैतिकता की दृष्टि से अपनी पहुंच सीमा । प्रसार और बीएम से प्राप्त MSCs की भिंनता क्षमता आम तौर पर दाता की उंर के साथ गिरावट आई है । इसके विपरीत, भ्रूण MSCs यूसी से प्राप्त जोरदार प्रसार और विभेदक क्षमता जैसे फायदे हैं. यूसी नमूने के लिए कोई नैतिक चिंता नहीं है, क्योंकि यह आम तौर पर चिकित्सा अपशिष्ट के रूप में माना जाता है । मानव यूसी हमल के 4-8 सप्ताह में एमनियोटिक गुहा के सतत विकास के साथ विकसित करने के लिए शुरू होता है और लंबाई में 50-60 सेमी तक पहुँचने तक बढ़ती रहती है, और यह पूरे नवजात प्रसव की अवधि के दौरान अलग किया जा सकता है । असभ्य रोगों के pathophysiology में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए, हम विभिंन गर्भावधि उंर में वितरित शिशुओं से uc-व्युत्पंन MSCs (uc-MSCs) का इस्तेमाल किया है । इस प्रोटोकॉल में, हम अलगाव और के लक्षण वर्णन UC-MSCs से भ्रूण के 19-40 सप्ताह के गर्भ में/
Introduction
Mesenchymal स्टेम सेल (MSCs) मूल रूप से अलग कर रहे है और अस्थि मज्जा (बीएम)1,2 से विशेषता है लेकिन यह भी वसा ऊतक, synovium, त्वचा, दंत लुगदी सहित ऊतकों की एक विस्तृत विविधता से प्राप्त किया जा सकता है, और भ्रूण उपांग 3. MSCs एक विषम कोशिका जनसंख्या के रूप में मांयता प्राप्त है कि पैदा करना और adipocytes, osteocytes, और chondrocytes में अंतर कर सकते हैं । इसके अलावा, MSCs चोट की साइटों के लिए विस्थापित करने की क्षमता के अधिकारी, दमन और प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को मिलाना, और फिर से तैयार है और चोट की मरंमत । वर्तमान में, विभिंन स्रोतों से MSCs ने कोशिका चिकित्सा के लिए एक स्रोत के रूप में बढ़ती ब्याज को आकर्षित किया है, जिसमें भ्रष्टाचार-बनाम-मेजबान रोग, रोधगलन, और मस्तिष्क रोधगलन4,5 शामिल हैं । .
हालांकि बीएम सबसे अच्छी तरह से MSCs के चरित्र का स्रोत है, बीएम आकांक्षा की आक्रामकता नैतिकता की दृष्टि से अपनी पहुंच सीमा । प्रसार और बीएम से प्राप्त MSCs की भिंनता क्षमता आम तौर पर दाता की उंर के साथ गिरावट आई है । इसके विपरीत, भ्रूण MSCs जैसे नाल, गर्भनाल रक्त (यूसीबी), और गर्भनाल (यूसी) के रूप में भ्रूण उपांग से प्राप्त नमूना और मजबूत प्रसार और भेदभाव क्षमता6 के बारे में कम नैतिक चिंताओं सहित लाभ है , 7. भ्रूण उपांग के बीच जो आमतौर पर मेडिकल कचरे के रूप में छोड़ दिया जाता है, यूसीबी और यूसी को भ्रूण अंग माना जाता है, जबकि अपरा को fetomaternal माना जाता है । इसके अलावा, अपरा और यूसीबी नवजात प्रसव के सही समय पर नमूना और एकत्र किए जाने की जरूरत है, जबकि अपरा और यूसी नवजात प्रसव के बाद एकत्र और संसाधित किया जा सकता है । तदनुसार, यूसी सेल थेरेपी8,9के लिए एक होनहार एमएससी स्रोत है.
मानव यूसी हमल के 4-8 सप्ताह में एमनियोटिक गुहा के प्रगतिशील विस्तार के साथ विकसित करने के लिए शुरू होता है, लंबाई में 50-60 सेमी तक विकसित करने के लिए जारी है, और नवजात प्रसव10की पूरी अवधि के दौरान अलग किया जा सकता है । असभ्य रोगों के pathophysiology में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए, हम विभिंन गर्भावधि उंर11,12पर दिया शिशुओं से uc-व्युत्पंन MSCs (uc-MSCs) का उपयोग करें । इस प्रोटोकॉल में, हम वर्णन कैसे अलग और UC-MSCs से भ्रूण के 19-40 सप्ताह के गर्भ में/
Protocol
Representative Results
Discussion
MSCs ऊतकों की एक किस्म से अलग किया जा सकता है और कोशिकाओं की विषम जनसंख्या है कि सभी एक ही phenotypic मार्करों व्यक्त नहीं कर रहे हैं । यहां, हम एक प्रोटोकॉल है कि समय और अवधि के शिशुओं से यूसी के संग्रह और विच्छेदन …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के लिए अनुदान में सहायता द्वारा समर्थित था वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए (ग) (अनुदान संख्या: २५४६१६४४) और युवा वैज्ञानिकों (ख) (अनुदान नंबर: 15K19614, २६८६०८४५, 17K16298) के JSPS KAKENHI.
Materials
| 50mL plastic tube | AS One Coporation, Osaka, Japan | Violamo 1-3500-22 | |
| 12-well plate | AGC Techno Glass, Tokyo, Japan | Iwaki 3815-012 | |
| 60mm dish | AGC Techno Glass, Tokyo, Japan | Iwaki 3010-060 | |
| Cell strainer (100 μm) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Falcon 35-2360 | |
| Cell strainer (70 μm) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Falcon 35-2350 | |
| Alpha MEM | Wako Pure Chemical, Osaka, Japan | 135-15175 | |
| Fetal bovine serum | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | 172012 | |
| Reduced serum medium | Thermo Fisher Scientific, waltham, MA | OPTI-MEM Gibco 31985-070 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Gibco 15240-062 | |
| Trypsin-EDTA | Wako Pure Chemical, Osaka, Japan | 209-16941 | |
| PBS | Takara BIO, Shiga,Japan | T900 | |
| Purified enzyme blends | Roche, Mannheim, Germany | Liberase DH Research Grade 05401054001 | |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD14 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 347497 | Lot: 3220644, RRID: AB_400312 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD19 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 340364 | Lot: 3198741, RRID: AB_400018 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD34 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555822 | Lot: 3079912, RRID: AB_396151 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD45 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555483 | Lot: 2300520, RRID: AB_395875 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD73 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 550257 | Lot: 3057778, RRID: AB_393561 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD90 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555596 | Lot: 3128616, RRID: AB_395970 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD105 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 560839 | Lot: 4339624, RRID: AB_2033932 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against HLA-DR | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 347367 | Lot: 3219843, RRID: AB_400293 |
| PE-conjugated mouse IgG1 k isotype | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555749 | Lot: 3046675, RRID: AB_396091 |
| PE-conjugated mouse IgG2a k isotype | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555574 | Lot: 3035934, RRID: AB_395953 |
| PE-conjugated mouse IgG2b k isotype | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555743 | Lot: 3098896, RRID: AB_396086 |
| Viability dye | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | Fixable Viability Stain 450 562247 | |
| Blocking reagent | Dainippon Pharmaceutical, Osaka, Japan | Block Ace UKB80 | |
| FCM | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | BD FACSAria III Cell Sorter | |
| FCM software | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | BD FACSDiva | |
| Adipogenic differentiation medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | StemPro Adipogenesis Differentiation kit A10070-01 | |
| Osteogenic differentiation medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | StemPro Osteogenesis Differentiation kit A10072-01 | |
| Chondrogenic differentiation medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | StemPro Chondrogenesis Differentiation kit A10071-01 | |
| Formaldehyde | Polyscience, Warrigton, PA | 16% UltraPure Formaldehyde EM Grade #18814 | |
| Oil Red O | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | O0625 | |
| Arizarin Red S | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | A5533 | |
| Toluidine Blue | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | 198161 | |
| Microscope | Keyence, Osaka, Japan | BZ-X700 |
References
- Friedenstein, A. J., Petrakova, K. V., Kurolesova, A. I., Frolova, G. P. Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues. Transplantation. 6 (2), 230-247 (1968).
- Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells. Journal of Orthopaedic Research. 9 (5), 641-650 (1991).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
- Bianco, P., Robey, P. G., Simmons, P. J. Mesenchymal Stem Cells: Revisiting History, Concepts, and Assays. Cell Stem Cell. 2 (4), 313-319 (2008).
- Bianco, P. 34;Mesenchymal" stem cells. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 677-704 (2014).
- Baksh, D., Yao, R., Tuan, R. S. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow. Stem Cells. 25 (6), 1384-1392 (2007).
- Manochantr, S., et al. Immunosuppressive properties of mesenchymal stromal cells derived from amnion, placenta, Wharton’s jelly and umbilical cord. Internal Medicine Journal. 43 (4), 430-439 (2013).
- Arutyunyan, I., et al. Umbilical Cord as Prospective Source for Mesenchymal Stem Cell-Based Therapy. Stem Cells International. 6901286, (2016).
- Davies, J. E., Walker, J. T., Keating, A. Concise Review: Wharton’s Jelly: The Rich, but Enigmatic, Source of Mesenchymal Stromal Cells. Stem Cells Translational Medicine. 6 (7), 1620-1630 (2017).
- Zhu, D., Wallace, E. M., Lim, R. Cell-based therapies for the preterm infant. Cytotherapy. 16 (12), 1614-1628 (2014).
- Iwatani, S., et al. Gestational Age-Dependent Increase of Survival Motor Neuron Protein in Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells. Frontiers in Pediatrics. 5, 194 (2017).
- Iwatani, S., et al. Involvement of WNT Signaling in the Regulation of Gestational Age-Dependent Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cell Proliferation. Stem Cells International. , 8749751 (2017).
- Mennan, C., et al. Isolation and characterisation of mesenchymal stem cells from different regions of the human umbilical cord. BioMed Research International. 916136, (2013).
- Capelli, C., et al. Minimally manipulated whole human umbilical cord is a rich source of clinical-grade human mesenchymal stromal cells expanded in human platelet lysate. Cytotherapy. 13 (7), 786-801 (2011).
- Lu, L. L., et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials. Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).
- Tong, C. K., et al. Generation of mesenchymal stem cell from human umbilical cord tissue using a combination enzymatic and mechanical disassociation method. Cell Biology International. 35 (3), 221-226 (2011).
- Han, Y. F., et al. Optimization of human umbilical cord mesenchymal stem cell isolation and culture methods. Cytotechnology. 65 (5), 819-827 (2013).
- Paladino, F. V., Peixoto-Cruz, J. S., Santacruz-Perez, C., Goldberg, A. C. Comparison between isolation protocols highlights intrinsic variability of human umbilical cord mesenchymal cells. Cell Tissue Bank. 17 (1), 123-136 (2016).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Mareschi, K., et al. Expansion of mesenchymal stem cells isolated from pediatric and adult donor bone marrow. Journal of Cellular Biochemistry. 97 (4), 744-754 (2006).
- Choumerianou, D. M., et al. Comparative study of stemness characteristics of mesenchymal cells from bone marrow of children and adults. Cytotherapy. 12 (7), 881-887 (2010).
- Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells and Development. 22 (17), 2425-2439 (2013).
