ヒト臍帯由来間葉系幹細胞から早産児と正期産児の分離と性状
1Department of Pediatrics,Kobe University Graduate School of Medicine, 2Department of Pathology,Kobe Children’s Hospital, 3Department of Pediatrics,Hyogo College of Medicine, 4Department of Developmental Pediatrics,Shizuoka Children’s Hospital, 5Department of Pediatrics,Nihon University School of Medicine
Summary
ひと臍帯 (UC) は、早産、用語は、結果として周産期の期間中に得ることができるし、postterm 配信。このプロトコルで述べる分離・同定 UC 由来間葉系幹細胞 (UC MSCs) の胎児・幼児から妊娠 19 40 週で。
Abstract
間葉系幹細胞 (Msc) はかなり治療可能性を秘めているし、バイオメディカル分野で注目を集めます。MSCs は、もともとに分離し骨髄 (BM) から特徴、脂肪組織、滑膜、皮膚、歯髄、胎盤など胎児附属物などの組織から得られる臍帯血 (UCB) と臍帯 (UC)。MSCs は、(1) 標準的な培養条件、(2) 表面マーカー発現 CD73 のプラスチックへの付着のための容量を持つ異種細胞集団+/CD90+/CD105+/CD45–/CD34–/CD14–/CD19–/HLA-DR–の表現型、および (3) 過形成分化脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、細胞療法 (ISCT) 国際社会で現在定義されています。BM は MSCs の最も広く使用されているソースが、BM 吸引の侵襲的な性質は倫理的、アクセシビリティを制限します。MSCs の増殖と分化の能力がバミューダ諸島から得られた一般的にドナーの年齢とともに減少します。対照的に、UC から得られる胎児の MSCs 活発な増殖と分化能力などの利点があります。それは通常、医療廃棄物としてみなされると UC のサンプリングで倫理的な懸念はありません。人間 UC 妊娠 4-8 週で羊膜腔の成長を継続的に開発を開始して長さ、50-60 cm に到達するまでの成長を続け、それは全新生児の配信期間中に分離することができます。難治性疾患の病態への洞察力を得るためには、様々 な妊娠年齢で提供される幼児から UC 由来 Msc (UC MSCs) を使いました。このプロトコルでは、分離、19-40 週間の妊娠時胎児・幼児から UC MSCs の評価について説明します。
Introduction
間葉系幹細胞 (MSCs) が分離された (BM)1,2骨髄から特徴、さまざまな組織の脂肪組織、滑膜、皮膚、歯髄、胎児附属物などから取得することも3。 MSCs が増殖と脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞に分化することができますする異種細胞集団として認識されます。また、MSCs は傷害のサイトに移行し、抑制する免疫応答を調節する能力を所有している改造し、傷害を修復します。さまざまなソースからの MSCs が数移植片対宿主病、心筋梗塞、脳梗塞45,などの難治性疾患に対する細胞治療のソースとして関心を集めている現在、.
BM は MSCs の最もよく特徴付けられたソースが、BM 吸引の侵襲性は倫理的、アクセシビリティを制限します。MSCs の増殖と分化の能力がバミューダ諸島から得られた一般的にドナーの年齢とともに減少します。これに対し、胎盤、臍帯血 (UCB) など胎児附属物から得られる胎児の MSCs と臍帯 (UC) サンプリングと堅牢な増殖と分化能力6についてあまり倫理的問題を含むの利点があります。,7します。 通常は医療廃棄物として破棄される胎児の肢、間 UCB と UC と見なされます胎児器官胎盤は臍と見なされます。さらに、胎盤と UCB サンプリングし、胎盤と UC を収集、新生児の配信後に処理されるに対し、新生児の配信の瞬間に収集する必要があります。したがって、UC は細胞療法8,9有望な MSC のソースです。
人間 UC 妊娠 4-8 週で羊膜腔の進歩的な拡張の開発を開始、50-60 cm の長さまで成長を続けている、新生児配信10の全体の期間中に分離することができます。難治性疾患の病態への洞察力を得るため、様々 な妊娠年齢11,12で提供される幼児から UC 由来 Msc (UC MSCs) を使用します。このプロトコルを特定し妊娠 19 40 週で胎児・幼児から UC MSCs を特徴付ける方法をについて説明します。
Protocol
この研究用ひと試料の使用は、神戸大学大学院医学部 (承認番号 1370 と 1694) の倫理委員会によって承認され、承認されたガイドラインに従って実施します。 1 UC MSCs の分離と培養 注:UC MSCs は正常に分離培養されているし、このプロトコルを拡張 (以上通路番号 4) 200 以上から UCs 受けます。200 以上の中で UCs、100% 示されている成功の UC MSC ?…
Representative Results
UC コレクションから MSC 文化までの手続きは、図 1にまとめます。約 5-10 cm の長さの UC は、すべての新生児の帝王から収集できます。UC は、妊娠の 4-8 週間で開発を開始して、図 2に示すように、長さ 50 ~ 60 cm まで成長を続けています。図 3と図 4に示すように、2 つの動脈 (A)、1 ?…
Discussion
MSCs は、といったさまざまな組織から分離することができますで、同じ表現型マーカーすべてエクスプレスを行う細胞の異種集団です。ここでは、我々 は早産児と正期の幼児からコレクションと UC の郭清をガイドして UC MSCs の分離と培養したりできるようにプロトコルを説明しました。このプロトコルに従って正常に胎児・幼児妊娠 19 40 週で配信され、難治性疾患の病態のいくつかの側面?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、Scientific Research (C) の補助金によって支えられた (許可番号: 25461644)、若手研究 (B) (番号を付与: 15 K 19614、26860845、17 K 16298) 日本学術振興会科研費の。
Materials
| 50mL plastic tube | AS One Coporation, Osaka, Japan | Violamo 1-3500-22 | |
| 12-well plate | AGC Techno Glass, Tokyo, Japan | Iwaki 3815-012 | |
| 60mm dish | AGC Techno Glass, Tokyo, Japan | Iwaki 3010-060 | |
| Cell strainer (100 μm) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Falcon 35-2360 | |
| Cell strainer (70 μm) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Falcon 35-2350 | |
| Alpha MEM | Wako Pure Chemical, Osaka, Japan | 135-15175 | |
| Fetal bovine serum | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | 172012 | |
| Reduced serum medium | Thermo Fisher Scientific, waltham, MA | OPTI-MEM Gibco 31985-070 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Gibco 15240-062 | |
| Trypsin-EDTA | Wako Pure Chemical, Osaka, Japan | 209-16941 | |
| PBS | Takara BIO, Shiga,Japan | T900 | |
| Purified enzyme blends | Roche, Mannheim, Germany | Liberase DH Research Grade 05401054001 | |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD14 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 347497 | Lot: 3220644, RRID: AB_400312 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD19 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 340364 | Lot: 3198741, RRID: AB_400018 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD34 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555822 | Lot: 3079912, RRID: AB_396151 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD45 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555483 | Lot: 2300520, RRID: AB_395875 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD73 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 550257 | Lot: 3057778, RRID: AB_393561 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD90 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555596 | Lot: 3128616, RRID: AB_395970 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD105 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 560839 | Lot: 4339624, RRID: AB_2033932 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against HLA-DR | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 347367 | Lot: 3219843, RRID: AB_400293 |
| PE-conjugated mouse IgG1 k isotype | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555749 | Lot: 3046675, RRID: AB_396091 |
| PE-conjugated mouse IgG2a k isotype | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555574 | Lot: 3035934, RRID: AB_395953 |
| PE-conjugated mouse IgG2b k isotype | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555743 | Lot: 3098896, RRID: AB_396086 |
| Viability dye | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | Fixable Viability Stain 450 562247 | |
| Blocking reagent | Dainippon Pharmaceutical, Osaka, Japan | Block Ace UKB80 | |
| FCM | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | BD FACSAria III Cell Sorter | |
| FCM software | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | BD FACSDiva | |
| Adipogenic differentiation medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | StemPro Adipogenesis Differentiation kit A10070-01 | |
| Osteogenic differentiation medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | StemPro Osteogenesis Differentiation kit A10072-01 | |
| Chondrogenic differentiation medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | StemPro Chondrogenesis Differentiation kit A10071-01 | |
| Formaldehyde | Polyscience, Warrigton, PA | 16% UltraPure Formaldehyde EM Grade #18814 | |
| Oil Red O | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | O0625 | |
| Arizarin Red S | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | A5533 | |
| Toluidine Blue | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | 198161 | |
| Microscope | Keyence, Osaka, Japan | BZ-X700 |
References
- Friedenstein, A. J., Petrakova, K. V., Kurolesova, A. I., Frolova, G. P. Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues. Transplantation. 6 (2), 230-247 (1968).
- Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells. Journal of Orthopaedic Research. 9 (5), 641-650 (1991).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
- Bianco, P., Robey, P. G., Simmons, P. J. Mesenchymal Stem Cells: Revisiting History, Concepts, and Assays. Cell Stem Cell. 2 (4), 313-319 (2008).
- Bianco, P. 34;Mesenchymal" stem cells. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 677-704 (2014).
- Baksh, D., Yao, R., Tuan, R. S. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow. Stem Cells. 25 (6), 1384-1392 (2007).
- Manochantr, S., et al. Immunosuppressive properties of mesenchymal stromal cells derived from amnion, placenta, Wharton’s jelly and umbilical cord. Internal Medicine Journal. 43 (4), 430-439 (2013).
- Arutyunyan, I., et al. Umbilical Cord as Prospective Source for Mesenchymal Stem Cell-Based Therapy. Stem Cells International. 6901286, (2016).
- Davies, J. E., Walker, J. T., Keating, A. Concise Review: Wharton’s Jelly: The Rich, but Enigmatic, Source of Mesenchymal Stromal Cells. Stem Cells Translational Medicine. 6 (7), 1620-1630 (2017).
- Zhu, D., Wallace, E. M., Lim, R. Cell-based therapies for the preterm infant. Cytotherapy. 16 (12), 1614-1628 (2014).
- Iwatani, S., et al. Gestational Age-Dependent Increase of Survival Motor Neuron Protein in Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells. Frontiers in Pediatrics. 5, 194 (2017).
- Iwatani, S., et al. Involvement of WNT Signaling in the Regulation of Gestational Age-Dependent Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cell Proliferation. Stem Cells International. , 8749751 (2017).
- Mennan, C., et al. Isolation and characterisation of mesenchymal stem cells from different regions of the human umbilical cord. BioMed Research International. 916136, (2013).
- Capelli, C., et al. Minimally manipulated whole human umbilical cord is a rich source of clinical-grade human mesenchymal stromal cells expanded in human platelet lysate. Cytotherapy. 13 (7), 786-801 (2011).
- Lu, L. L., et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials. Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).
- Tong, C. K., et al. Generation of mesenchymal stem cell from human umbilical cord tissue using a combination enzymatic and mechanical disassociation method. Cell Biology International. 35 (3), 221-226 (2011).
- Han, Y. F., et al. Optimization of human umbilical cord mesenchymal stem cell isolation and culture methods. Cytotechnology. 65 (5), 819-827 (2013).
- Paladino, F. V., Peixoto-Cruz, J. S., Santacruz-Perez, C., Goldberg, A. C. Comparison between isolation protocols highlights intrinsic variability of human umbilical cord mesenchymal cells. Cell Tissue Bank. 17 (1), 123-136 (2016).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Mareschi, K., et al. Expansion of mesenchymal stem cells isolated from pediatric and adult donor bone marrow. Journal of Cellular Biochemistry. 97 (4), 744-754 (2006).
- Choumerianou, D. M., et al. Comparative study of stemness characteristics of mesenchymal cells from bone marrow of children and adults. Cytotherapy. 12 (7), 881-887 (2010).
- Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells and Development. 22 (17), 2425-2439 (2013).
Cite This Article
Iwatani, S., Yoshida, M., Yamana, K., Kurokawa, D., Kuroda, J., Thwin, K. K. M., Uemura, S., Takafuji, S., Nino, N., Koda, T., Mizobuchi, M., Nishiyama, M., Fujioka, K., Nagase, H., Morioka, I., Iijima, K., Nishimura, N. Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants. J. Vis. Exp. (143), e58806, doi:10.3791/58806 (2019).