Isolering og karakterisering av menneskelig navlestreng-avledet Mesenchymal stamceller fra premature og Term spedbarn
Summary
Menneskelige navlestreng (UC) kan fås i perinatalperioden som følge av premature, sikt, og postterm levering. I denne protokollen beskriver vi isolering og karakterisering av UC-avledet stamceller (UC-MSCs) fra fostre/spedbarn på 19-40 uker av svangerskapet.
Abstract
Stamceller (MSCs) har betydelig terapeutiske potensial og tiltrekke økende interesse innen biomedisinsk. MSCs er opprinnelig isolert og preget fra benmargen (BM), så kjøpt fra tissues inkluderer fettvev, fagområder, hud, tannlegekontoret masse og fosterets vedheng som morkaken, navlestrengsblod (UCB) og navlestreng (UC). MSCs er en heterogen celle befolkning med kapasitet for (1) overholdelse av plast i standard oppdrettsforholdene, (2) overflate markør uttrykk for CD73+/CD90+/CD105+/CD45–/CD34–/CD14–/CD19 –/HLA-DR– fenotyper og (3) trilineage differensiering i adipocytter, osteocytes og chondrocytes, som er definert av International Society for mobilnettet terapi (ISCT). Selv om BM er den vanligste kilden til MSCs, begrenser invasiv art på BM aspirasjon etisk sin tilgjengelighet. Spredning og differensiering kapasitet på MSCs innhentet fra BM vanligvis avta med alderen av donor. Derimot har fosterets MSCs fra UC fordeler som energisk spredning og differensiering kapasitet. Det er ingen etiske bekymring for UC prøvetaking, som det er vanligvis betraktet som medisinsk avfall. Menneskelige UC begynner å utvikle med fortsatt vekst av amniotic hulrommet på 4-8 uker av svangerskapet og holder vokser fram 50-60 cm i lengde, og det kan isoleres under hele nyfødte leveransen periode. For å få innsikt i Patofysiologien ved vanskelige sykdommer, har vi brukt UC-avledet MSCs (UC-MSCs) fra spedbarn leveres i ulike svangerskapsdiabetes alder. I denne protokollen beskriver vi isolering og karakterisering av UC-MSCs fra fostre/spedbarn på 19-40 uker av svangerskapet.
Introduction
Stamceller (MSCs) er opprinnelig isolert og preget fra benmargen (BM)1,2 , men kan også fås fra en rekke tissues inkluderer fettvev, fagområder, hud, tannlegekontoret masse og fosterets vedheng 3. MSCs er anerkjent som en heterogen celle befolkningen som kan spre og differensiere i adipocytter, osteocytes og chondrocytes. I tillegg MSCs har muligheten til å migrere til stedene for skade, undertrykke og modulere immunreaksjoner, renovere og reparere skader. Foreløpig har MSCs fra ulike kilder fått økende interesse som kilde for cellen terapi mot en rekke vanskelige sykdommer, inkludert graft – versus – host sykdom, hjerteinfarkt og hjerneinfarkt4,5 .
Selv om BM er mest godt karakterisert MSCs, begrenser invasiveness av BM aspirasjon etisk sin tilgjengelighet. Spredning og differensiering kapasitet på MSCs innhentet fra BM vanligvis avta med alderen av donor. Derimot fosterets MSCs innhentet fra fosterets vedheng som morkaken, navlestrengsblod (UCB), og navlestreng (UC) har fordeler inkludert mindre Etiske bekymringene om prøvetaking og robust spredning og differensiering kapasitet6 , 7. blant fosterets vedheng som forkastes vanligvis som medisinsk avfall, UCB og UC anses en fosterets orgel, mens morkaken regnes fetomaternal. I tillegg må morkaken og UCB samplet og samlet på det nøyaktige tidspunktet for nyfødte levering, mens morkaken og UC kan samles inn og behandles etter nyfødte levering. Følgelig er UC en lovende MSC kilde for cellen terapi8,9.
Menneskelige UC begynner å utvikle med progressiv utvidelse av amniotic hulrommet på 4-8 uker av svangerskapet, fortsetter å vokse til 50-60 cm i lengde og kan isoleres i hele perioden av nyfødte levering10. For å få innsikt i Patofysiologien ved vanskelige sykdommer, bruker vi UC-avledet MSCs (UC-MSCs) fra spedbarn levert på ulike svangerskapsdiabetes alderen11,12. I denne protokollen beskriver vi hvordan å isolere og karakterisere UC-MSCs fra fostre/spedbarn på 19-40 uker av svangerskapet.
Protocol
Representative Results
Discussion
MSCs kan isoleres fra en rekke vev og er heterogen befolkning som gjør ikke alle express samme fenotypiske markører. Her skissert vi en protokoll som styrer innsamling og Disseksjon av UC fra premature og begrepet spedbarn og aktiverer isolasjon og kultur av UC-MSCs. Etter denne protokollen, har vi lykkes isolert UC-MSCs som oppfyller ISCT kriterier19 fra fostre/spedbarn levert på 19-40 uker av svangerskapet og viste at de representerer noen aspekter av uløselige sykdom patofysiologi under pre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Grants-in-Aid for Scientific Research (C) (gi nummer: 25461644) og unge forskere (B) (gi tall: 15 K 19614, 26860845, 17 K 16298) av JSPS KAKENHI.
Materials
| 50mL plastic tube | AS One Coporation, Osaka, Japan | Violamo 1-3500-22 | |
| 12-well plate | AGC Techno Glass, Tokyo, Japan | Iwaki 3815-012 | |
| 60mm dish | AGC Techno Glass, Tokyo, Japan | Iwaki 3010-060 | |
| Cell strainer (100 μm) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Falcon 35-2360 | |
| Cell strainer (70 μm) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Falcon 35-2350 | |
| Alpha MEM | Wako Pure Chemical, Osaka, Japan | 135-15175 | |
| Fetal bovine serum | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | 172012 | |
| Reduced serum medium | Thermo Fisher Scientific, waltham, MA | OPTI-MEM Gibco 31985-070 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Gibco 15240-062 | |
| Trypsin-EDTA | Wako Pure Chemical, Osaka, Japan | 209-16941 | |
| PBS | Takara BIO, Shiga,Japan | T900 | |
| Purified enzyme blends | Roche, Mannheim, Germany | Liberase DH Research Grade 05401054001 | |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD14 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 347497 | Lot: 3220644, RRID: AB_400312 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD19 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 340364 | Lot: 3198741, RRID: AB_400018 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD34 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555822 | Lot: 3079912, RRID: AB_396151 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD45 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555483 | Lot: 2300520, RRID: AB_395875 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD73 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 550257 | Lot: 3057778, RRID: AB_393561 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD90 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555596 | Lot: 3128616, RRID: AB_395970 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD105 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 560839 | Lot: 4339624, RRID: AB_2033932 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against HLA-DR | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 347367 | Lot: 3219843, RRID: AB_400293 |
| PE-conjugated mouse IgG1 k isotype | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555749 | Lot: 3046675, RRID: AB_396091 |
| PE-conjugated mouse IgG2a k isotype | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555574 | Lot: 3035934, RRID: AB_395953 |
| PE-conjugated mouse IgG2b k isotype | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555743 | Lot: 3098896, RRID: AB_396086 |
| Viability dye | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | Fixable Viability Stain 450 562247 | |
| Blocking reagent | Dainippon Pharmaceutical, Osaka, Japan | Block Ace UKB80 | |
| FCM | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | BD FACSAria III Cell Sorter | |
| FCM software | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | BD FACSDiva | |
| Adipogenic differentiation medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | StemPro Adipogenesis Differentiation kit A10070-01 | |
| Osteogenic differentiation medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | StemPro Osteogenesis Differentiation kit A10072-01 | |
| Chondrogenic differentiation medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | StemPro Chondrogenesis Differentiation kit A10071-01 | |
| Formaldehyde | Polyscience, Warrigton, PA | 16% UltraPure Formaldehyde EM Grade #18814 | |
| Oil Red O | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | O0625 | |
| Arizarin Red S | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | A5533 | |
| Toluidine Blue | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | 198161 | |
| Microscope | Keyence, Osaka, Japan | BZ-X700 |
References
- Friedenstein, A. J., Petrakova, K. V., Kurolesova, A. I., Frolova, G. P. Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues. Transplantation. 6 (2), 230-247 (1968).
- Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells. Journal of Orthopaedic Research. 9 (5), 641-650 (1991).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
- Bianco, P., Robey, P. G., Simmons, P. J. Mesenchymal Stem Cells: Revisiting History, Concepts, and Assays. Cell Stem Cell. 2 (4), 313-319 (2008).
- Bianco, P. 34;Mesenchymal" stem cells. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 677-704 (2014).
- Baksh, D., Yao, R., Tuan, R. S. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow. Stem Cells. 25 (6), 1384-1392 (2007).
- Manochantr, S., et al. Immunosuppressive properties of mesenchymal stromal cells derived from amnion, placenta, Wharton’s jelly and umbilical cord. Internal Medicine Journal. 43 (4), 430-439 (2013).
- Arutyunyan, I., et al. Umbilical Cord as Prospective Source for Mesenchymal Stem Cell-Based Therapy. Stem Cells International. 6901286, (2016).
- Davies, J. E., Walker, J. T., Keating, A. Concise Review: Wharton’s Jelly: The Rich, but Enigmatic, Source of Mesenchymal Stromal Cells. Stem Cells Translational Medicine. 6 (7), 1620-1630 (2017).
- Zhu, D., Wallace, E. M., Lim, R. Cell-based therapies for the preterm infant. Cytotherapy. 16 (12), 1614-1628 (2014).
- Iwatani, S., et al. Gestational Age-Dependent Increase of Survival Motor Neuron Protein in Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells. Frontiers in Pediatrics. 5, 194 (2017).
- Iwatani, S., et al. Involvement of WNT Signaling in the Regulation of Gestational Age-Dependent Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cell Proliferation. Stem Cells International. , 8749751 (2017).
- Mennan, C., et al. Isolation and characterisation of mesenchymal stem cells from different regions of the human umbilical cord. BioMed Research International. 916136, (2013).
- Capelli, C., et al. Minimally manipulated whole human umbilical cord is a rich source of clinical-grade human mesenchymal stromal cells expanded in human platelet lysate. Cytotherapy. 13 (7), 786-801 (2011).
- Lu, L. L., et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials. Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).
- Tong, C. K., et al. Generation of mesenchymal stem cell from human umbilical cord tissue using a combination enzymatic and mechanical disassociation method. Cell Biology International. 35 (3), 221-226 (2011).
- Han, Y. F., et al. Optimization of human umbilical cord mesenchymal stem cell isolation and culture methods. Cytotechnology. 65 (5), 819-827 (2013).
- Paladino, F. V., Peixoto-Cruz, J. S., Santacruz-Perez, C., Goldberg, A. C. Comparison between isolation protocols highlights intrinsic variability of human umbilical cord mesenchymal cells. Cell Tissue Bank. 17 (1), 123-136 (2016).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Mareschi, K., et al. Expansion of mesenchymal stem cells isolated from pediatric and adult donor bone marrow. Journal of Cellular Biochemistry. 97 (4), 744-754 (2006).
- Choumerianou, D. M., et al. Comparative study of stemness characteristics of mesenchymal cells from bone marrow of children and adults. Cytotherapy. 12 (7), 881-887 (2010).
- Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells and Development. 22 (17), 2425-2439 (2013).
