Method Article

무기 Polyphosphate 박테리아에 대 한 시 금

DOI:

10.3791/58818

⸱

January 21st, 2019

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology, University of Alabama at Birmingham, 2Division of Infectious Diseases, University of Alabama at Birmingham

In This Article

Summary

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그람 양성, 그람 음성, mycobacterial 종 등 다양 한 박테리아에 무기 polyphosphate의 급속 한 정량화를 위한 간단한 방법을 설명 합니다.

Abstract

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무기 polyphosphate (폴립) 셀 생활의 모든 도메인에 있는 생물학 고분자 이며 독성 및 많은 박테리아에 스트레스 반응. 많은 노동 집약 하거나 구분 하지 않습니다, 그들의 유용성을 제한 하는 생물 자료에 측량 용 종에 대 한 방법의 다양 한이 있다. 선물이 여기 박테리아, 부 량 폴립에 대 한 효율적인된 방안을 여러 샘플, 폴립 전용 exopolyphosphatase ScPPX와 폴립의 소화 및 감지의 신속한 처리를 위해 최적화 된 실리 카 막 열 추출 사용 하는 결과 민감한 ascorbic 산 기반 색도계 분석 결과 함께 무료 인산 염. 이 절차 간단, 저렴, 이며 다양 한 세균성 종에 신뢰할 수 있는 폴립 정량화를 수 있습니다. 그램 음성 박테리아 (대장균), 그람 양성 젖 산 박테리아 (유산 균 reuteri), 및 mycobacterial 종 (진 균 smegmatis)에서 대표적인 폴립 정량화 선물이. 우리는 또한 어떤은 현재 상업적으로 사용할 수 밀리 그램 양의 ScPPX, 니켈 친 화력 정화에 대 한 간단한 프로토콜 포함.

Introduction

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무기 polyphosphate (폴립)은 인생1,2,3의 모든 도메인에 있는 phosphoanhydride 연결 인산 염 단위의 선형 biopolymer 이다. 다양 한 박테리아에서 폴립 스트레스 반응, 운동 성, biofilm 형성, 세포 주기 제어, 항생제 내성, 및 독성4,,56,7,8이 필수적입니다. ,9,,1011. 박테리아 물질 대사 폴립의 연구는 따라서 질병의 원인이 다양 한 환경에서 번 창 하는 박테리아의 기능에 대 한 근본적인 통찰력을 얻을 수가 있다. 그러나 많은 경우에,, 세균성 세포 측정 폴립에 대 한 사용할 수 있는 방법 이러한 ....

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Protocol

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1. 정화 효 모 Exopolyphosphatase (ScPPX)

  1. 대장균 단백질 overexpression 스트레인 플라스 미드 pScPPX26 BL21(DE3)31 electroporation32 또는33화학 변환 의해 변환.
  2. Lysogeny 국물 (파운드) 100 µ g mL-1 암 피 실린 포함 하는 pScPPX2 BL21(DE3)의 단일 식민지와 2 L unbaffled 플라스 크에 포함 된의 1 L를 접종 하 고 하룻밤 없이 떨고, 600에서 흡 광도를 37 ° C에서 품 어 nm (600)의 약 0.3, 한 분 광 광도 계에서 측정 된
  3. (180 rpm)를 동요 하는 문화를 시작 하 고 어느 시간 동안 셀 A600 0.4-의 성장 37 ° C에서 30 분 동안 품 어 0.5.
  4. 1mm 및는 추가 100 µ g mL-1 암 피 실린의 최종 농도에 이소프로필 β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)를 추가한 다음 180 rpm에서 떨고....

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Results

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프로토콜의 주요 단계는 diagrammed 그림 1에서 단순화 된 형태에서.

그램 음성 박테리아, 야생-타입 E. 콜라 이 프로토콜의 사용을 MG165539 파운드에서 37 ° C (200 rpm) 떨고 풍부한 매체에 중간 로그 단계로 성장, 다음 씻어 서 되었고에 추가 2 h에 대 한 인 큐베이 팅 morpholinopropanesulfonate 버퍼 (MOPS) 최소한의 중간40 4 g L-1 포도 당 및 0.1 m m K2HPO4, 폴립14,29

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Discussion

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여기에 설명 된 프로토콜 간소화 되 고 완전히 처리 약 1.5 h 복용 24 샘플의 전형적인 세트와 함께 다양 한 박테리아에서 폴립 레벨의 정량화를 가속 한다. 이 샘플의 신속한 심사 및 돌연변이 라이브러리의 분석을 허용 하 고 운동 실험 시간이 지남에 폴립의 축적을 측정을 단순화 합니다. 우리는 프로토콜 대표자 3 다른 문의에 효과적으로 작동 증명: proteobacteria firmicutes, 그리고 actinobacteria, 그들의 탄력에 대 한 악명을 lyse 세포 벽49어렵다.

ScPPX와 소화에 의해 폴립의 탐지 더 구체적이 고 형광 탐지 DAPI와 함께 보다 더 민감한 이며 저렴 하 고 ppk 모델을 사용 하 여 ATP 폴립의 전환 보다 더 기술적으로 간단. ScPPX DNA와 RNA12에 의해 저해입니다, 하지만 우리는 6000 이상 nmol 폴립 mg-1 .......

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Disclosures

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저자는 공개 없다.

Acknowledgements

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이 프로젝트는 알라바 마의 대학 버밍엄과 미생물학의 시동 자금 및 NIH 부여 R35GM124590 (MJG), 및 NIH 부여 R01AI121364 (FW)에 지원 됩니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
E. coli BL21(DE3)Millipore Sigma69450
플라스미드 pScPPX2Addgene112877학술 및 기타 비영리 기관에서 사용 가능
LB brothFisher ScientificBP1427-2E. coli 성장 배지
암피실린Fisher ScientificBP176025
이소프로필 &베타;-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG)골드 생명공학I2481C
HEPES 버퍼골드 생명공학H-400-1
수산화칼륨(KOH)HEPES 완충 용액의 pH 조정을 위한Fisher ScientificP250500
염화나트륨(NaCl)Fisher ScientificS27110
이미다졸Fisher ScientificO3196500
라이소자임Fisher ScientificAAJ6070106
염화마그네슘(MgCl2)Fisher ScientificBP214-500
Pierce Universal NucleaseFisher ScientificPI88700Benzonase(Sigma-Aldrich cat. # E1014)는 허용 가능한 대체품입니다
120 음파 분석기Fisher ScientificFB-120다른 세포 용해 방법(예: French Press)도 효과적일 수 있으며
5mL HiTrap 킬레이트 HP 컬럼GE Life Sciences17040901모든 니켈 친화성 크로마토그래피 컬럼 또는 수지로 치환될 수 있으며,
를 충전하기 위해니켈(II) 황산염 육수화물Fisher Scientific
. m 기공 크기 셀룰로오스 아세테이트 주사기 필터Fisher Scientific09-302-168
Bradford 시약Bio-Rad5000205
Tris 버퍼Fisher ScientificBP1525
스펙트럼  Spectra/Por 4 RC 투석막 튜빙 12,000 - 14,000 Dalton MWCOFisher Scientific08-667BMWCO < 30,000 Da의 기타 투석막도 작동해야 합니다
.Fisher ScientificA144-212트리스 완충 용액의 pH 조절을 위해
염화칼륨(KCl)Fisher ScientificP217500
글리세롤Fisher ScientificBP2294
10x MOPS 매체 혼합물TeknovaM2101E. 대장균 성장 매체
포도당Fisher ScientificD161
일염기성 인산칼륨(KH2PO4)Fisher ScientificBP362-500
이염기성 인산칼륨(K2HPO4)Fisher ScientificBP363-500
탈수 효모 추출물Fisher ScientificDF0886-17-0
트립톤Fisher ScientificBP1421-500
황산마그네슘 헵타하이드레이트Fisher ScientificM63-50
황산망간 일수화물Fisher ScientificM113-500
구아니딘 이소티오시아네이Fisher ScientificBP221-250
소 혈청 알부민(프로테아제 없음)Fisher ScientificBP9703100
투명 평면 바닥 96웰 플레이트Sigma-AldrichM0812-100EA투명 96웰 플레이트가 작동합니다
Tecan M1000 Infinite 플레이트 리더Tecan, Inc.해당 사항 없음595 및 882 nm에서 흡광도를 측정할 수 있는 모든 플레이트 리더는
에탄올Fisher Scientific04-355-451
실리카 멤브레인 스핀 컬럼Epoch Life Science1910-050/250
에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)Fisher ScientificBP120500
1.5mL 마이크로퓨지 튜브Fisher ScientificNC9580154
아세트산 암모늄Fisher ScientificA637-500
안티몬 주석산 칼Fisher ScientificAAA1088922
4 N 황산 (H2SO4)Fisher ScientificSA818-500
암모늄 헵타몰리브덴산Fisher ScientificAAA1376630
아스코르브산Fisher 과학AC401471000
. 모델 , HiTrap 컬럼 0.8 µ AC415611000로 대체할 수 있습니다는 트 륨

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rao, N. N., Gomez-Garcia, M. R., Kornberg, A. Inorganic polyphosphate: essential for growth and survival. Annual Review of Biochemistry. 78, 605-647 (2009).
  2. Achbergerova, L., Nahalka, J. Polyphosphate--an ancient energy source and active metabolic regulator.....

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