マウス萌芽期の神経幹細胞の分離と培養
Summary
E13マウス胚神経節隆起から顕微鏡下神経幹細胞の分離法を紹介します。
Abstract
神経幹細胞 (NSCs) は多能性、中枢神経系 (CNS) の 3 つの主要な細胞型に上昇を与えることができます。生体外で文化と NSCs の拡大は、ニューロンの機能を研究する神経科学者のための細胞との相互作用とグリア細胞の適切なソースを提供します。大人または胚の哺乳動物の脳からの神経の幹細胞の隔離のためのいくつかの報告されたテクニックがあります。胚の中枢神経系のさまざまな地域から NSCs を分離する顕微鏡の操作中にライブと拡張可能な幹細胞の最も高い比率を取得する脳細胞にダメージを軽減する非常に重要です。マウス胎児脳からこれらのセルの隔離中にストレス解消する方法は、手術時間の削減です。ここでは、E13マウス胚神経節隆起からこれらの細胞の迅速単離技術の開発を示します。手術は、頭蓋、神経節隆起を収穫するため分離脳のレーザーマイクロダイ セクションから脳を抽出、曲がった針の先端を持つ胚の前頭部泉門を切断、子宮から E13マウス胚を収穫解離の単一細胞懸濁液を得るために NSC 培地で収穫された組織と最後にめっき細胞懸濁培養神経幹細胞を生成します。
Introduction
大人と胚の脳の異なる領域に存在する神経幹細胞 (NSCs) とニューロンとグリア細胞1のさまざまな種類を生成する傾向があります。2大人の哺乳類の脳の脳室下帯のゾーンと胚の脳神経節隆起は、NSC の豊富な地域の3です。発展途上の脳では、神経節隆起は皮質介在ニューロンと特に gaba 作動性介在ニューロンの3のほとんどを提供します。動物の需要を減らす誘導多能性幹細胞 (Ips) を使用または胚性幹細胞 (Esc) から神経幹細胞生成のため少ない侵襲的方法もあります。Esc または Ips から NSCs の生成が可能な4,5であるにもかかわらず、それは、いくつかの長所と短所、大人または胚脳6,7、神経幹細胞の分離と比較されます。 8。Esc と Ips の神経細胞への分化誘導のためのプロトコルは、常に時間とコストを消費し、成功 (70-80 %nestin 陽性細胞)5の率は低かった動物の頭脳 (から NSCs の直接分離以上 99 %nestin 陽性細胞)9。また、幹細胞は、いくつかの通路10,11の後遺伝的安定性と分化傾向を失います。NSCs に体細胞の直接の変換については、他の新しいレポートがあるにもかかわらずこれらの細胞は遺伝子組み換えし、は簡単にすべての演習12でアクセスできません。したがって、動物の脳からの神経の幹細胞の隔離のための大きな需要はまだあります。手術技術の向上によって動物の使用量を低減することが可能です。手術時間を短縮して、技術の向上により、損傷から細胞を維持し、それぞれの動物から NSCs の最高速度を取得することが可能です。
ここでは、E13胎児の脳の神経幹細胞の隔離のための簡体字で再現可能な手法を紹介します。
Protocol
Representative Results
Discussion
神経幹細胞の適切なソースを使用しては、神経科学者に非常に重要です。神経幹細胞は胎児の脳の異なる領域から悪用される可能性が、ニューロンとグリア細胞の特定の種類を生成することができます。成熟したニューロンとグリア細胞を生成するように誘導する神経幹細胞の分化誘導方法はいくつかあります。特定のカルチャ条件および栄養要因の連隊の下ニューロン14?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、ロワイヤン研究所によって支えられました。
Materials
| 15 mL tubes | Falcon | 352097 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352235 | |
| Adson Forceps, 12 cm, Straight | WPI | 14226 | |
| B27 | Gibco | 17504-44 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | |
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| dish 10cm | Falcon | 353003 | |
| Dressing Forceps, 12.5 cm, Straight | WPI | 15908 | |
| Dumont Tweezers, 11 cm, Straight | WPI | 500342 | |
| EGF | Sigma | E9644 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Glutamate | Sigma | G3291 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| goat anti rabbit FITC conjugated secondary antibody | Sigma | AP307F | |
| goat serum | Sigma | G9023 | |
| Heparin | Sigma | h3149 | |
| HEPES | Sigma | 83264 | |
| HEPES | Sigma | 90909C | |
| insulinsyringe with 25-27 gauge Needle | SUPA medical | A1SNL127 | |
| laminin | sigma | L2020 | |
| MEM | Sigma | M2279 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| NB medium | Gibco | 21103-31 | |
| Non-essential amino acid (NEAA) | Gibco | 11140050 | |
| PBS without Ca and Mg | Gibco | 20012050 | |
| Penicilin/ Streptomycin | Gibco | 5140122 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma | P4957 | |
| rabbit anti mouse beta tubulin-III antibody | Sigma | T2200 | |
| rabbit anti mouse GFAP antibody | Sigma | G4546 | |
| rabbit anti mouse Nestin antibody | Sigma | N5413 | |
| Scalpel Handle #3 | WPI | 500236 | |
| Scissors curve | WPI | 14396 | |
| Scissors sharp straight | WPI | 14192 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Roche | 10109886001 | |
| Tissue culture flasks, T25 | BD | 353014 | |
| Tissue culture flasks, T75 | BD | 353024 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Vannas Scissors, 8 cm, Straight | WPI | 14003 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 |
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