JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
화학

Escherichia coli-המבוסס על סינתזת החלבון ללא תא: פרוטוקולים עבור טכנולוגיית פלטפורמה חזקים, גמישים ונגישים

Published: February 25, 2019
doi:
10.3791/58882
, , , ,
1Department of Biological Sciences,California Polytechnic State University, San Luis Obispo, 2Center for Applications in Biotechnology,California Polytechnic State University, San Luis Obispo, 3Department of Chemistry and Biochemistry,California Polytechnic State University, 4Department of Chemical and Biological Engineering,Northwestern University, 5Chemistry of Life Processes Institute,Northwestern University, 6Center for Synthetic Biology,Northwestern University, 7Interdisciplinary Biological Sciences Program,Northwestern University

Summary

פרוטוקול זה מפרט את השלבים, ‘ עלויות ‘ הציוד הנדרש לייצר e. coli-המבוסס על תמציות תא וליישם במבחנה תגובות סינתזת חלבון תוך 4 ימים או פחות. למנף את אופי גמיש הפלטפורמה עבור יישומים רחב, נדון תנאי ריאקציה, כי ניתן להתאים אופטימיזציה.

Abstract

במהלך 50 השנים האחרונות, סינתזה של חלבון נטול תאים (CFPS) התפתחה טכנולוגיה רבת עוצמה כדי לרתום את קיבולת גנים ברמת השעתוק והתרגום של תאים בתוך מבחנה. על ידי obviating הצורך לשמר את הכדאיות של התא, על ידי ביטול המכשול הסלולר, CFPS כבר למעין המתעוררים יישומים ב- biomanufacturing של חלבונים מאתגרת באופן מסורתי, כמו גם יישומים שטנץ מהירה עבור הנדסה מטבולית, גנומיקה תפקודית. השיטות שלנו ליישום של e. coli-מבוסס פלטפורמת CFPS לאפשר למשתמשים חדשים רבים של יישומים אלה. כאן, אנו מתארים שיטות להכין תמצית באמצעות מדיה מועשר מבחנות במבוכה, שיטה ישימה של פירוק התא מבוסס sonication tunable. זו תמצית ואז ניתן ביטוי חלבון מסוגל לייצר µg 900/mL או יותר של חלבון פלואורסצנטי ירוק סופר תיקיה (sfGFP) ברק 5 שעות מהגדרת הניסוי כדי ניתוח נתונים, בהתחשב בכך ריאגנט המתאים מניות שהוכנו מראש. העלות המשוערת הפעלה של קבלת ריאגנטים הוא 4,500 דולר אשר יתמוך אלפי תגובות בעלות של $0.021 לכל µg של חלבון המיוצר או $0.019 לכל µL של תגובה. בנוסף, השיטות ביטוי חלבון מראה את הקלות של ההתקנה התגובה ראיתי במערכות זמינים מסחרית עקב אופטימיזציה של ריאגנט תערובות מראש, בכל חלק של העלות. כדי לאפשר למשתמש למנף את אופי גמיש פלטפורמת CFPS עבור יישומים רחב, זיהינו במגוון היבטים של פלטפורמת שניתן מכוון או מותאם בהתאם המשאבים הזמינים לבין התוצאות של ביטוי חלבון הרצוי.

Introduction

סינתזת חלבון נטול תאים (CFPS) התפתחה טכנולוגיה נעול מספר הזדמנויות חדשות עבור ייצור החלבון, גנומיקה תפקודית, הנדסה מטבולית ועוד בתוך1,50 שנה שעברה2. לעומת תקן ויוו פלטפורמות ביטוי חלבון, CFPS מספק שלושה יתרונות מרכזיים: 1) הטבע ללא תא של הפלטפורמה מאפשרת הייצור של חלבונים זה יהיה פוטנציאל רעיל או זרות תא3,4 5, ,6; 2) איון של הדנ א, ההקדמה של תבנית ה-DNA קידוד של gene (s) עניין לנתב את כל האנרגיה מערכתית בתוך התגובה לייצור של protein(s) עניין; ו 3) מהות הפלטפורמה הפתוחה מאפשר למשתמש לשנות ולנטר את תנאי ריאקציה ו קומפוזיציה בזמן אמת7,8. זו גישה ישירה אל התגובה תומך את הגדלת של מערכות ביולוגיות עם תנאים חמצון-חיזור לייצור חלבונים הרומן, כוונון של תהליכים מטבוליים2,9, וא מורחב 10. ישיר גישה גם מאפשר למשתמש לשלב את התגובה CFPS עם פעילות מבחני במערכת יחיד-סיר עבור מהירה יותר-מבחן עיצוב לבנות מחזורי11. היכולת לבצע את התגובה CFPS נפח קטן טיפות או במכשירים המבוססים על נייר נוספת תומך במאמצי הגילוי תפוקה גבוהה, שטנץ מהירה12,13,14,15 ,16. בשל יתרונות אלה ואת אופי הכנס-הפעל של המערכת, CFPS באופן ייחודי איפשר מגוון רחב של יישומי ביוטכנולוגיה למשל, ייצור חלבונים שקשה לבטא solubly ויוו17, 18,19,20, הגילוי של המחלה21,22,23, על פי דרישה biomanufacturing18,24 ,25,26,27, ו חינוך28,29, אשר כולם להראות את הגמישות ואת השירות של פלטפורמת נטול תאים.

CFPS מערכות יכול להיווצר מתוך מגוון של lysates גסה של שני הקווים תא prokaryotic, האיקריוטים. דבר זה מאפשר אפשרויות מגוונות במערכת של בחירה, שלכל אחד מהם יש יתרונות וחסרונות בהתאם ליישום של עניין. CFPS מערכות גם שוני רב בין זמן הכנה, עלות, יעילות. הכי נפוץ מנוצל תא תמציות מופקות מן נבט חיטה, ארנב רטיקולוציט, חרקים תאים ותאים Escherichia coli , הלה. החסכוני ביותר לתאריך תוך כדי לייצר את התשואות הנפחי הגבוה ביותר של חלבון30 . בעוד מערכות אחרות CFPS יכול להיות יתרון עבור מכונות מולדת השינוי post-translational שלהם, המתעוררים יישומים המשתמשים של e. coli-מכונות מבוסס מסוגלים לגשר על הפער על ידי יצירת site-specifically phosphorylated, חלבונים glycosylated על פי דרישה31,32,33,34,35.

תגובות CFPS ניתן להפעיל גם אצווה, רציף-exchange תא-חינם (CECF) או תבניות (CFCF) ללא תאים זרימה רציפה. הפורמט אצווה הוא מערכת סגורה החיים התגובה שלו הוא מוגבל בשל שמפחית כמויות המגיבים ואת ההצטברות של תוצרי לוואי המעכבת של התגובה. CECF ושיטות CFCF להגדיל את אורך החיים של התגובה, ובכך לגרום התשואות חלבון נפח מוגבר לעומת התגובה אצווה. זו מושגת על-ידי מתן לוואי של סינתזת חלבונים להסיר מיכל התגובה בזמן המגיבים חדשים מסופקים לאורך כל הקורס של התגובה2. במקרה של CFCF, החלבון של עניין ניתן גם להסיר מן החדר התגובה, תוך כדי CECF, החלבון שרידי עניין בבית הבליעה התגובה המורכב של36,קרום חדיר למחצה37. שיטות אלה יקרים במיוחד להתגבר על עניים התשואות הנפחי של חלבונים-קשה-אקספרס של עניין38,39,40,41,42, 43. האתגרים ביישום הגישות CECF ו- CFCF הם 1) בעוד הם תוצאה של שימוש יעיל יותר של מכונות ביו אחראי תמלול ותרגום, הם דורשים כמויות גדולות יותר ובמיוחד של ריאגנטים המגבירה העלות הכוללת ו- 2) הם דורשים setups התגובה מורכבים יותר, ציוד מיוחד לעומת אצווה תבנית44. על מנת להבטיח נגישות עבור משתמשים חדשים, הפרוטוקולים המפורטים להלן המיקוד על הפורמט אצווה בעוצמות התגובה של µL 15 עם המלצות ספציפיות להגברת שעוצמת התגובה הסולם מיליליטר.

השיטות שהוצגו במסמך זה לאפשר שאינם מומחים עם מיומנויות מעבדה בסיסיות (כגון סטודנטים לתואר ראשון) ליישם את צמיחת תאים, לחלץ הכנה של אצווה תבנית התגובה ההתקנה עבור e. coli-CFPS מערכת מבוססת. גישה זו היא חסכונית לעומת ערכות זמינים מסחרית מבלי להתפשר על הקלות של התגובה מבוסס ערכת ההתקנה. יתר על כן, גישה זו מאפשרת יישומים במעבדה ובשדה. כאשר אתה מחליט ליישם CFPS, משתמשים חדשים כדאי ביסודיות להעריך את היעילות של חלבון קונבנציונאלי מערכות ביטוי להשקעה הפעלה, כפי CFPS לא יכול להיות מעולה בכל מקרה. CFPS בשיטות המתוארות כאן לאפשר למשתמש ליישם באופן ישיר מגוון רחב של יישומים, כולל גנומיקה תפקודית, בדיקות, ייצור חלבונים שאינן פתירות ויוו הביטוי, כמו גם שדה תפוקה גבוהה יישומים כולל ביולוגיים וערכות חינוכיות עבור ביולוגיה סינתטית. יישומים נוספים כגון הנדסה מטבולית, כוונון של תנאי ביטוי חלבון, גילוי מחלות ושימוש הסולם בשיטות CECF או CFCF עדיין אפשריים אך עשויים לדרוש ניסיון עם פלטפורמת CFPS עבור שינוי נוסף של התגובה תנאים. השיטות שלנו לשלב הגידול, צלוחיות, בושם במבוכה ומדיה מועשר עם יחסית מהירה ושיטות לשחזור של פירוק התא דרך sonication, ואחריו מלכודת התגובה CFPS מפושטת אשר מנצל premixes ממוטבת45. בעוד השיטות צמיחה סלולרי צריך להיות סטנדרטית במידה מסוימת בתוך שדה זה, שיטות פירוק תאים משתנים במידה רבה. בנוסף sonication, שיטות פירוק הנפוצות כוללות הניצול של מכבש צרפתי, עם מהמגן, חלמוני חרוז, או ליזוזים אחרים שיבוש ביוכימי ופיזית שיטות46,47,48, 49. באמצעות השיטות שלנו, כ 2 מ ל תמצית תא גולמי מתקבלים לכל 1 ליטר של תאים. כמות זו של תמצית התא יכול לתמוך ארבע מאות תגובות CFPS µL 15, כל לעשיית ~ 900 µg/mL של הכתב sfGFP חלבון מן התבנית פלסמיד pJL1-sfGFP. בשיטה זו עלויות $0.021/µg של sfGFP מיוצר (.019$ / µL של תגובה), ללא העלות של עבודה וציוד (משלימה איור 1). מתחיל מאפס, בשיטה זו ניתן ליישם כבר 4 ימים על ידי אדם אחד וחזור CFPS תגובות יכולה להסתיים תוך שעות (איור 1). בנוסף, ניתן לשנות את הפרוטוקול באמצעי אחסון עבור אצוות גדול יותר של ריאגנט הכנה לצרכים של המשתמש. חשוב, ניתן ליישם את הפרוטוקול המובאת כאן על ידי מעבדה שהוכשרו הלא-מומחים כגון סטודנטים לתואר ראשון, כפי שהוא רק דורש מיומנויות מעבדה בסיסית. ההליכים המתוארים להלן ווידאו המלווה את פותחו במיוחד כדי לשפר את הנגישות של פלטפורמת CFPS e. coli לשימוש רחב.

Protocol

1. התקשורת והכנה צמיחת תאים יום 1 רצף של e. coli BL21*(DE3) תאים גליצרול במניה על גבי צלחת אגר LB ואת תקופת דגירה של פחות 18 h ב- 37 מעלות צלזיוס. הכנת 50 מ ל LB ומדיה אוטוקלב הפתרון על מחזור הנוזל למשך 30 דקות-121 מעלות צלזיוס. לאחסן בטמפרטורת החדר. יום 2 …

Representative Results

הוצגו מבוסס sonication e. coli תמצית פרוטוקול הכנה ניתן להשלים במשך תקופה ארבעה ימים, עם איור 1 הממחיש את התפלגות פרוצדורלי מעל כל יום. אין גמישות כדי השלבים ניתן להשלים כל יום עם נקודות משהה שונות, אבל מצאנו את זרימת עבודה זו כדי להיות היעיל ביותר לביצוע. בנוס…

Discussion

סינתזה של חלבון נטול תא התפתחה טכנולוגיה חזקה ומאפשרת למגוון רחב של יישומים החל biomanufacturing וכלה שטנץ מהירה של מערכות ביוכימיות. רוחב היריעה של יישומים נתמך על ידי היכולת לפקח, לתמרן, להגדיל מכונות הסלולר בזמן אמת. למרות ההשפעה המתרחב של טכנולוגיה זו פלטפורמה, נותרה רחבה הסתגלות איטית עקב הד?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחברים רוצה להכיר ד ר ג’ניפר VanderKelen, אנדריאה Laubscher, ואת טוני Turretto לתמיכה טכנית, ווסלי קאו, ליין ויליאמס ו כריסטופר Hight לדיונים מועיל. המחברים גם לאשר מימון תמיכה מן ביל ו לינדה פרוסט קרן, מרכז עבור יישומים של ביוטכנולוגיה שברון ביוטכנולוגיה חלה הקרן למחקר גרנט, קאל פולי מחקר, Scholarly ו תוכנית גרנט פעילות יצירתית (RSCA 2017), הקרן הלאומית למדע (NSF-1708919). MZL מאשר מענק בוגר את המדינה אוניברסיטת קליפורניה. MCJ מכיר את הצבא מחקר במשרד W911NF-16-1-0372, הלאומית למדע מעניקה MCB-1413563 ו MCB-1716766, את חיל האוויר מחקר מעבדה מרכז מצוינות גרנט FA8650-15-2-5518, המענק סוכנות ההגנה צמצום האיום HDTRA1-15-10052/P00001, דוד ואת ולוסיל פקארד קרן, לתוכנית המורה-מלומד קמיל דרייפוס, המחלקה של אנרגיה בער גרנט דה-SC0018249, תוכנית המדע האנושי הגבולות (RGP0015/2017), המענק ETOP המכון הגנום המאוחד DOE, ו שיקגו ביו. האיחוד עם תמיכה של הכספים סרל ב שיקגו הקהילה לסמוך על התמיכה.

Materials

Luria Broth ThermoFisher 12795027
Tryptone Fisher Bioreagents 73049-73-7
Yeast Extract Fisher Bioreagents 1/2/8013
NaCl Sigma-Aldrich S3014-1KG
Potassium Phosphate Dibasic Sigma-Aldrich 60353-250G
Potassium Phosphate Monobasic Sigma-Aldrich P9791-500G
D-Glucose Sigma-Aldrich G8270-1KG
KOH Sigma-Aldrich P5958-500G
IPTG Sigma-Aldrich I6758-1G
Mg(OAc)2 Sigma-Aldrich M5661-250G
K(OAc) Sigma-Aldrich P1190-1KG
Tris(OAc) Sigma-Aldrich T6066-500G
DTT ThermoFisher 15508013
tRNA Sigma-Aldrich 10109541001
Folinic Acid Sigma-Aldrich F7878-100MG
NTPs ThermoFisher R0481
Oxalic Acid Sigma-Aldrich P0963-100G
NAD Sigma-Aldrich N8535-15VL
CoA Sigma-Aldrich C3144-25MG
PEP Sigma-Aldrich 860077-250MG
K(Glu) Sigma-Aldrich G1501-500G
NH4(Glu) MP Biomedicals 02180595.1
Mg(Glu)2 Sigma-Aldrich 49605-250G
Spermidine Sigma-Aldrich S0266-5G
Putrescine Sigma-Aldrich D13208-25G
HEPES ThermoFisher 11344041
Molecular Grade Water Sigma-Aldrich 7732-18-5
L-Aspartic Acid Sigma-Aldrich A7219-100G
L-Valine Sigma-Aldrich V0500-25G
L-Tryptophan Sigma-Aldrich T0254-25G
L-Phenylalanine Sigma-Aldrich P2126-100G
L-Isoleucine Sigma-Aldrich I2752-25G
L-Leucine Sigma-Aldrich L8000-25G
L-Cysteine Sigma-Aldrich C7352-25G
L-Methionine Sigma-Aldrich M9625-25G
L-Alanine Sigma-Aldrich A7627-100G
L-Arginine Sigma-Aldrich A8094-25G
L-Asparagine Sigma-Aldrich A0884-25G
Glycine Sigma-Aldrich G7126-100G
L-Glutamine Sigma-Aldrich G3126-250G
L-Histadine Sigma-Aldrich H8000-25G
L-Lysine Sigma-Aldrich L5501-25G
L-Proline Sigma-Aldrich P0380-100G
L-Serine Sigma-Aldrich S4500-100G
L-Threonine Sigma-Aldrich T8625-25G
L-Tyrosine Sigma-Aldrich T3754-100G
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 2.0 mL Fisher Scientific 05-408-138
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL Fisher Scientific 05-408-129
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 0.6 mL Fisher Scientific 05-408-120
PureLink HiPure Plasmid Prep Kit ThermoFisher K210007
Ultrasonic Processor QSonica Q125-230V/50Hz 3.175 mm diameter probe
Avanti J-E Centrifuge Beckman Coulter 369001
JLA-8.1000 Rotor Beckman Coulter 366754
1L Centrifuge Tube Beckman Coulter A99028
Tunair 2.5L Baffeled Shake Flask Sigma-Aldrich Z710822
Microfuge 20 Beckman Coulter B30134
New Brunswick Innova 42/42R Incubator Eppendorf M1335-0000
Cytation 5 BioTek
Strep-Tactin XT Starter Kit IBA 2-4998-000
pJL1-sfGFP Addgene 69496
BL21(DE3) New England BioLabs
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jiang, L., Zhao, J., Lian, J., Xu, Z. Cell-free protein synthesis enabled rapid prototyping for metabolic engineering and synthetic biology. Synthetic and Systems Biotechnology. 3 (2), 90-96 (2018).
  2. Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: Applications come of age. Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).
  3. Watanabe, M. Cell-Free Protein Synthesis for Structure Determination by X-ray Crystallography. Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 607, 149-160 (2010).
  4. Martemyanov, K. A., Shirokov, V. A., Kurnasov, O. V., Gudkov, A. T., Spirin, A. S. Cell-Free Production of Biologically Active Polypeptides: Application to the Synthesis of Antibacterial Peptide Cecropin. Protein Expression and Purification. 21 (3), 456-461 (2001).
  5. Renesto, P., Raoult, D. From genes to proteins: in vitro expression of rickettsial proteins. Annals of the New York Academy of Sciences. 990, 642-652 (2003).
  6. Xu, Z., Chen, H., Yin, X., Xu, N., Cen, P. High-Level Expression of Soluble Human b-Defensin-2 Fused With Green Fluorescent Protein in Escherichia coli Cell-Free System. Applied Biochemistry and Biotechnology. 127 (1), 053-062 (2005).
  7. Baumann, A. In-situ observation of membrane protein folding during cell-free expression. PLoS ONE. 11 (3), 1-15 (2016).
  8. Wang, Y., Percival, Y. H. P. Cell-free protein synthesis energized by slowly-metabolized maltodextrin. BMC Biotechnology. 9, 1-8 (2009).
  9. Whittaker, J. W. Cell-free protein synthesis: the state of the art. Biotechnology Letters. 35 (2), 143-152 (2013).
  10. Martin, R. W. Cell-free protein synthesis from genomically recoded bacteria enables multisite incorporation of noncanonical amino acids. Nature Communications. 9 (1), 1203 (2018).
  11. Kwon, Y. C., Song, J. K., Kim, D. M. Cloning-Independent Expression and Screening of Enzymes Using Cell-Free Protein Synthesis Systems. Methods in Molecular Biology. 1118, 97-108 (2014).
  12. Chappell, J., Jensen, K., Freemont, P. S. Validation of an entirely in vitro approach for rapid prototyping of DNA regulatory elements for synthetic biology. Nucleic Acids Research. 41 (5), 3471-3481 (2013).
  13. Takahashi, M. K. Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions. Methods. 86, 60-72 (2015).
  14. Karim, A. S., Jewett, M. C. A cell-free framework for rapid biosynthetic pathway prototyping and enzyme discovery. Metabolic Engineering. 36, 116-126 (2016).
  15. Dudley, Q. M., Anderson, K. C., Jewett, M. C. Cell-Free Mixing of Escherichia coli Crude Extracts to Prototype and Rationally Engineer High-Titer Mevalonate Synthesis. ACS Synthetic Biology. 5 (12), 1578-1588 (2016).
  16. Pardee, K. Paper-based synthetic gene networks. Cell. 159 (4), 940-954 (2014).
  17. Zawada, J. F. Microscale to manufacturing scale-up of cell-free cytokine production-a new approach for shortening protein production development timelines. Biotechnology and Bioengineering. 108 (7), 1570-1578 (2011).
  18. Sullivan, C. J. A cell-free expression and purification process for rapid production of protein biologics. Biotechnology Journal. 11 (2), 238-248 (2016).
  19. Li, J. Cell-free protein synthesis enables high yielding synthesis of an active multicopper oxidase. Biotechnology Journal. 11 (2), 212-218 (2016).
  20. Heinzelman, P., Schoborg, J. A., Jewett, M. C. pH responsive granulocyte colony-stimulating factor variants with implications for treating Alzheimer’s disease and other central nervous system disorders. Protein Engineering Design and Selection. 28 (10), 481-489 (2015).
  21. Pardee, K. Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
  22. Slomovic, S., Pardee, K., Collins, J. J. Synthetic biology devices for in vitro and in vivo diagnostics. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (47), 14429-14435 (2015).
  23. Gootenberg, J. S. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 356 (6336), 438-442 (2017).
  24. Pardee, K. Portable, On-Demand Biomolecular Manufacturing. Cell. 167 (1), 248-259 (2016).
  25. Karig, D. K., Bessling, S., Thielen, P., Zhang, S., Wolfe, J. Preservation of protein expression systems at elevated temperatures for portable therapeutic production. Journal of the Royal Society, Interface. 14 (129), (2017).
  26. Smith, M. T., Berkheimer, S. D., Werner, C. J., Bundy, B. C. Lyophilized Escherichia coli-based cell-free systems for robust, high-density, long-term storage. BioTechniques. 56 (4), 186-193 (2014).
  27. Hunt, J. P., Yang, S. O., Wilding, K. M., Bundy, B. C. The growing impact of lyophilized cell-free protein expression systems. Bioengineered. 8 (4), 325-330 (2017).
  28. Stark, J. C. BioBitsTM Bright: A fluorescent synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), (2018).
  29. Huang, A. BioBitsTM Explorer: A modular synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), (2018).
  30. Zemella, A., Thoring, L., Hoffmeister, C., Kubick, S. Cell-Free Protein Synthesis: Pros and Cons of Prokaryotic and Eukaryotic Systems. ChemBioChem. 16 (17), 2420-2431 (2015).
  31. Oza, J. P. Robust production of recombinant phosphoproteins using cell-free protein synthesis. Nature Communications. 6 (1), 8168 (2015).
  32. Zemella, A. Cell-free protein synthesis as a novel tool for directed glycoengineering of active erythropoietin. Scientific Reports. 8 (1), 8514 (2018).
  33. Jaroentomeechai, T. Single-pot glycoprotein biosynthesis using a cell-free transcription-translation system enriched with glycosylation machinery. Nature Communications. 9 (1), 2686 (2018).
  34. Kightlinger, W. Design of glycosylation sites by rapid synthesis and analysis of glycosyltransferases. Nature Chemical Biology. 14 (6), 627-635 (2018).
  35. Schoborg, J. A. A cell-free platform for rapid synthesis and testing of active oligosaccharyltransferases. Biotechnology and Bioengineering. 115 (3), 739-750 (2018).
  36. Chekulayeva, M. N., Kurnasov, O. V., Shirokov, V. A., Spirin, A. S. Continuous-Exchange Cell-Free Protein-Synthesizing System: Synthesis of HIV-1 Antigen Nef. Biochemical and Biophysical Research Communications. 280 (3), 914-917 (2001).
  37. Hong, S. H. Improving Cell-Free Protein Synthesis through Genome Engineering of Escherichia coli Lacking Release Factor 1. ChemBioChem. 16 (5), 844-853 (2015).
  38. Endo, Y., Otsuzuki, S., Ito, K., Miura, K. Production of an enzymatic active protein using a continuous flow cell-free translation system. Journal of Biotechnology. 25 (3), 221-230 (1992).
  39. Volyanik, E. V., Dalley, A., Mckay, I. A., Leigh, I., Williams, N. S., Bustin, S. A. Synthesis of Preparative Amounts of Biologically Active Interleukin-6 Using a Continuous-Flow Cell-Free Translation System. Analytical Biochemistry. 214 (1), 289-294 (1993).
  40. Martin, G. A., Kawaguchi, R., Lam, Y., DeGiovanni, A., Fukushima, M., Mutter, W. High-yield, in vitro protein expression using a continuous-exchange, coupled transcription/ translation system. BioTechniques. 31 (4), 948-950 (2001).
  41. Stech, M., Quast, R. B., Sachse, R., Schulze, C., Wüstenhagen, D. A., Kubick, S. A Continuous-Exchange Cell-Free Protein Synthesis System Based on Extracts from Cultured Insect Cells. PLoS ONE. 9 (5), e96635 (2014).
  42. Quast, R. B., Sonnabend, A., Stech, M., Wüstenhagen, D. A., Kubick, S. High-yield cell-free synthesis of human EGFR by IRES-mediated protein translation in a continuous exchange cell-free reaction format. Scientific Reports. 6 (1), 30399 (2016).
  43. Thoring, L., Dondapati, S. K., Stech, M., Wüstenhagen, D. A., Kubick, S. High-yield production of "difficult-to-express" proteins in a continuous exchange cell-free system based on CHO cell lysates. Scientific Reports. 7 (1), 11710 (2017).
  44. Hoffmann, M., Nemetz, C., Madin, K., Buchberger, B. Rapid translation system: A novel cell-free way from gene to protein. Biotechnology annual review. 10, 1-30 (2004).
  45. Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5 (1), 8663 (2015).
  46. Katsura, K. A reproducible and scalable procedure for preparing bacterial extracts for cell-free protein synthesis. Journal of Biochemistry. 162 (June), 357-369 (2017).
  47. Fujiwara, K., Doi, N. Biochemical preparation of cell extract for cell-free protein synthesis without physical disruption. PLoS ONE. 11 (4), 1-15 (2016).
  48. Shrestha, P., Holland, T. M., Bundy, B. C. Streamlined extract preparation for Escherichia coli-based cell-free protein synthesis by sonication or bead vortex mixing. BioTechniques. 53 (3), 163-174 (2012).
  49. Krinsky, N. A Simple and Rapid Method for Preparing a Cell-Free Bacterial Lysate for Protein Synthesis. PLoS ONE. 11 (10), (2016).
  50. Jewett, M. C., Swartz, J. R. Mimicking the Escherichia coli cytoplasmic environment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis. Biotechnology and Bioengineering. 86 (1), 19-26 (2004).
  51. Swartz, J. R., Jewett, M. C., Woodrow, K. A. Cell-Free Protein Synthesis With Prokaryotic Combined Transcription-Translation. Recombinant Gene Expression. (267), 169-182 (2004).
  52. Voloshin, A. M., Swartz, J. R. Efficient and scalable method for scaling up cell free protein synthesis in batch mode. Biotechnology and Bioengineering. 91 (4), 516-521 (2005).
  53. Vernon, W. B. The role of magnesium in nucleic-acid and protein metabolism. Magnesium. 7 (5-6), 234-248 (1988).
  54. Pratt, J. M. . Transcription and Translation: A Practical Approach. , (1984).
  55. Kim, D. M., Kigawa, T., Choi, C. Y., Yokoyama, S. A Highly Efficient Cell-Free Protein Synthesis System from Escherichia coli. European Journal of Biochemistry. 239 (3), 881-886 (1996).
  56. Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4 (1), 8 (2010).
  57. Zubay, G. In Vitro Synthesis of Protein in Microbial Systems. Annual Review of Genetics. 7 (1), 267-287 (1973).
  58. Kigawa, T. Preparation of Escherichia coli cell extract for highly productive cell-free protein expression. Journal of Structural and Functional Genomics. 5 (1/2), 63-68 (2004).
  59. Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. Streamlining Escherichia Coli S30 Extract Preparation for Economical Cell-Free Protein Synthesis. Biotechnology Progress. 21 (2), 460-465 (2008).
  60. Yang, W. C., Patel, K. G., Wong, H. E., Swartz, J. R. Simplifying and streamlining Escherichia coli-based cell-free protein synthesis. Biotechnology Progress. 28 (2), 413-420 (2012).
  61. Foshag, D. The E. coli S30 lysate proteome: A prototype for cell-free protein production. New Biotechnology. 40 (Pt B), 245-260 (2018).
  62. Caschera, F. Bacterial cell-free expression technology to in vitro systems engineering and optimization. Synthetic and Systems Biotechnology. 2 (2), 97-104 (2017).
  63. Chizzolini, F., Forlin, M., Yeh Martín, N., Berloffa, G., Cecchi, D., Mansy, S. S. Cell-Free Translation Is More Variable than Transcription. ACS Synthetic Biology. 6 (4), 638-647 (2017).
  64. Hong, S. H., Kwon, Y. C., Jewett, M. C. Non-standard amino acid incorporation into proteins using Escherichia coli cell-free protein synthesis. Frontiers in Chemistry. 2, 34 (2014).
  65. Sawasaki, T., Ogasawara, T., Morishita, R., Endo, Y. A cell-free protein synthesis system for high-throughput proteomics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (23), 14652-14657 (2002).
  66. Dudley, Q. M., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free metabolic engineering: Biomanufacturing beyond the cell. Biotechnology Journal. 10 (1), 69-82 (2015).
  67. Garcia, D. C. Elucidating the potential of crude cell extracts for producing pyruvate from glucose. Synthetic Biology. 3 (1), 1-9 (2018).
  68. Hurst, G. B. Proteomics-Based Tools for Evaluation of Cell-Free Protein Synthesis. Analytical Chemistry. 89 (21), 11443-11451 (2017).

Tags

Keywords: Escherichia ColiCell-free Protein SynthesisProtocolPlatform TechnologyFunctional GenomicsBiosensorsMetabolic EngineeringGenetic Code ExpansionCentrifugationS30 BufferDTTResuspensionAliquoting
check_url/kr/58882?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. J. Vis. Exp. (144), e58882, doi:10.3791/58882 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image