In Vitro modello di differenziazione delle cellule di memoria umana normale B a plasmacellule longevo
Summary
Utilizzando sistemi di coltura di multi-step, segnaliamo un in vitro delle cellule B al modello di differenziazione delle cellule di plasma.
Abstract
Le cellule di plasma (pz) secernono grandi quantità di anticorpi e si sviluppano dalle cellule di B che sono state attivate. PC sono rare cellule situate nel midollo osseo o mucosa e garantire l’immunità umorale. A causa della loro bassa frequenza e la posizione, lo studio dei PC è difficile nell’essere umano. Abbiamo segnalato un B per PC modello di differenziazione in vitro utilizzando combinazioni selezionate di citochine e l’attivazione di molecole che consentono di riprodurre la differenziazione delle cellule sequenziale che si verificano in vivo. In questo modello in vitro, cellule di B (MBCs) differenzierà in pre-plasmablasts (prePBs), plasmablasts (PBs), presto PC memoria e infine, longevo pz, con un fenotipo vicino alle loro controparti in individui sani. Abbiamo inoltre sviluppato un accesso aperto bioinformatica strumenti per analizzare le informazioni più importanti dai dati GEP legate alla differenziazione di PC. Queste risorse possono essere utilizzate per studiare umano B alla differenziazione di PC e nello studio corrente, abbiamo studiato la regolazione dell’espressione genica di fattori epigenetici durante B umana alla differenziazione di PC.
Introduction
La differenziazione dei linfociti B a plasmacellule (pz) è essenziale per l’immunità umorale e proteggere l’ospite contro le infezioni1. B alla differenziazione di PC è associata con importanti cambiamenti nel metabolismo e capacità di trascrizione per ospitare a secrezione dell’anticorpo. I fattori di trascrizione che controllano B alla differenziazione di PC sono stati ampiamente studiati e rivelate reti esclusive tra cui trascrizione B – e PC-specifici fattori (TFs)2. In cellule di B, PAX5, BCL6 e BACH2 TFs sono i guardiani delle cellule B identità2,3. Induzione di IRF4, PRDM1 codifica BLIMP1 e XBP1 PC TF sarà estinguere i geni delle cellule B e indurre un coordinato disecrezione cella programma trascrizionale3,4,5. Queste modifiche trascrizionali coordinate sono associate con attivazione di trascrizione di geni Ig insieme con un interruttore dal modulo membrana-limita per la forma secreta della catena pesante dell’immunoglobulina2,3, 4. B alla differenziazione di PC è collegato con l’induzione di geni coinvolti nel reticolo endoplasmatico e Apparato del Golgi funzioni concomitante con l’attivazione di risposta (UPR) spiegata della proteina conosciuta per svolgere un ruolo chiave nel PC ospitando la sintesi di secreto immunoglobuline6,7. Il TF XBP1 svolge un ruolo importante in questo adattamento cellulare8,9,10.
Linfociti B e i PC sono attori chiave della immunità umorale. Comprendere il biologico, i processi che controllano la produzione e la sopravvivenza delle cellule di plasma normale è cruciale in interventi terapeutici che devono garantire efficienti risposte immunitarie e prevenire l’autoimmunità o immunodeficienza. PC sono rare cellule con le fasi iniziali di differenziazione che si svolgono nelle posizioni anatomiche che ostacolano la caratterizzazione biologico completo, particolarmente nell’uomo. Utilizzando sistemi di coltura di multi-step, abbiamo segnalato un B in vitro al modello di differenziazione del PC. Questo modello riproduce il sequenziale di differenziamento e maturazione che si verificano in diversi organi in vivo11,12,13. In una prima fase, le cellule B di memoria sono attivate in primo luogo per quattro giorni da CD40 ligando, oligodeoxynucleotides e citochina combinazione e differenziano in preplasmablasts (PrePBs). In una seconda fase, preplasmablasts sono indotte a differenziarsi in plasmablasts (PBs) rimuovendo la stimolazione CD40L e oligodeoxynucleotides e cambiando la combinazione di citochina. In una terza fase, plasmablasts sono indotte a differenziarsi nei primi PC modificando la citochina combinazione11,12. Un quarto passo è stato introdotto per ottenere pienamente matura pz coltivando questi primi PC con medium condizionate di cellule stromali di midollo osseo o selezionati fattori di crescita13. Questi PC maturi potrebbero sopravvivere parecchi mesi in vitro e secernono una quantità elevata di immunoglobulina (Figura 1). È interessante notare che, il nostro modello in vitro ricapitola le modifiche trascrizionali coordinate e il fenotipo della B diverso a fasi di PC che possono essere rilevati in vivo11,12,13,14 ,15. I PC sono rare cellule e il nostro modello di differenziazione in vitro permette di studiare umano B alla differenziazione di PC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Negli umani, PC sono rare cellule con fasi di differenziazione che si svolgono in luoghi anatomici che ostacolare la caratterizzazione biologico completo. Abbiamo sviluppato un B in vitro per modello di differenziazione PC utilizzando sistemi di coltura multifase dove varie combinazioni di molecole di attivazione e citochine vengono successivamente applicate al fine di riprodurre il differenziamento sequenziale che si verificano nella diversi organi/tessuti in vivo11,1…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal francese INCA (Institut National du Cancer) Institute (PLBIO15-256), ANR (Tie-Skip) e cancro ITMO (MM & TT).
Materials
| anti-CD2 magnetic beads | Invitrogen | 11159D | |
| Anti-CD138-APC | Beckman-Coulter | B49219 | |
| Anti-CD19-APC | BD | 555415 | |
| Anti-CD20-PB | Beckman-Coulter | B49208 | |
| Anti-CD27-PE | BD | 555441 | |
| Anti-CD38-PE | Beckman-Coulter | A07779 | |
| Anti-histidine | R&D Systems | MAB050 | |
| CpG ODN(PT) | Sigma | T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C* G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T |
|
| human Transferin | Sigma-Aldrich | T3309 | |
| IFN-α | Merck | Intron A | |
| IMDM | Gibco | 31980-022 | |
| Recombinan Human CD40L-hi | R&D Systems | 2706-CL | |
| Recombinant Human APRIL | R&D Systems | 5860-AP-010 | |
| Recombinant Human IL-10 | R&D Systems | 217-IL- | |
| Recombinant Human IL-15 | Peprotech | 200-15-10ug | |
| Recombinant Human IL-2 Protein | R&D Systems | 202-IL- | |
| Recombinant Human IL-6 | Peprotech | 200-06 |
References
- Shapiro-Shelef, M., Calame, K. Regulation of plasma-cell development. Nature Reviews Immunology. 5 (3), 230-242 (2005).
- Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. The generation of antibody-secreting plasma cells. Nature Reviews Immunology. 15 (3), 160-171 (2015).
- Shaffer, A. L., et al. Blimp-1 orchestrates plasma cell differentiation by extinguishing the mature B cell gene expression program. Immunity. 17 (1), 51-62 (2002).
- Minnich, M., et al. Multifunctional role of the transcription factor Blimp-1 in coordinating plasma cell differentiation. Nature Immunology. 17 (3), 331-343 (2016).
- Klein, U., et al. Transcription factor IRF4 controls plasma cell differentiation and class-switch recombination. Nature Immunology. 7 (7), 773-782 (2006).
- Gass, J. N., Gunn, K. E., Sriburi, R., Brewer, J. W. Stressed-out B cells? Plasma-cell differentiation and the unfolded protein response. Trends in Immunology. 25 (1), 17-24 (2004).
- Goldfinger, M., Shmuel, M., Benhamron, S., Tirosh, B. Protein synthesis in plasma cells is regulated by crosstalk between endoplasmic reticulum stress and mTOR signaling. European Journal of Immunology. 41 (2), 491-502 (2011).
- Yoshida, H., Matsui, T., Yamamoto, A., Okada, T., Mori, K. XBP1 mRNA is induced by ATF6 and spliced by IRE1 in response to ER stress to produce a highly active transcription factor. Cell. 107 (7), 881-891 (2001).
- Shaffer, A. L., et al. XBP1, downstream of Blimp-1, expands the secretory apparatus and other organelles, and increases protein synthesis in plasma cell differentiation. Immunity. 21 (1), 81-93 (2004).
- Reimold, A. M., et al. Plasma cell differentiation requires the transcription factor XBP-1. Nature. 412 (6844), 300-307 (2001).
- Jourdan, M., et al. Characterization of a transitional preplasmablast population in the process of human B cell to plasma cell differentiation. Journal of Immunology. 187 (8), 3931-3941 (2011).
- Jourdan, M., et al. An in vitro model of differentiation of memory B cells into plasmablasts and plasma cells including detailed phenotypic and molecular characterization. Blood. 114 (25), 5173-5181 (2009).
- Jourdan, M., et al. IL-6 supports the generation of human long-lived plasma cells in combination with either APRIL or stromal cell-soluble factors. Leukemia. , (2014).
- Kassambara, A., et al. Global miRNA expression analysis identifies novel key regulators of plasma cell differentiation and malignant plasma cell. Nucleic Acids Research. 45 (10), 5639-5652 (2017).
- Kassambara, A., et al. GenomicScape: an easy-to-use web tool for gene expression data analysis. Application to investigate the molecular events in the differentiation of B cells into plasma cells. PLOS Computational Biology. 11 (1), 1004077 (2015).
- Miremadi, A., Oestergaard, M. Z., Pharoah, P. D., Caldas, C. Cancer genetics of epigenetic genes. Human Molecular Genetics. 16, 28-49 (2007).
- Pei, H., et al. The histone methyltransferase MMSET regulates class switch recombination. Journal of Immunology. 190 (2), 756-763 (2013).
- Le Gallou, S., et al. IL-2 requirement for human plasma cell generation: coupling differentiation and proliferation by enhancing MAPK-ERK signaling. Journal of Immunology. 189 (1), 161-173 (2012).
- Cocco, M., et al. In vitro generation of long-lived human plasma cells. Journal of Immunology. 189 (12), 5773-5785 (2012).
- Leung-Hagesteijn, C., et al. Xbp1s-negative tumor B cells and pre-plasmablasts mediate therapeutic proteasome inhibitor resistance in multiple myeloma. Cancer Cell. 24 (3), 289-304 (2013).
- Orlowski, R. Z. Why proteasome inhibitors cannot ERADicate multiple myeloma. Cancer Cell. 24 (3), 275-277 (2013).
- Ding, B. B., Bi, E., Chen, H., Yu, J. J., Ye, B. H. IL-21 and CD40L synergistically promote plasma cell differentiation through upregulation of Blimp-1 in human B cells. Journal of Immunology. 190 (4), 1827-1836 (2013).
- Tsai, C. M., et al. Galectin-1 promotes immunoglobulin production during plasma cell differentiation. Journal of Immunology. 181 (7), 4570-4579 (2008).
- Tsai, C. M., et al. Galectin-1 and galectin-8 have redundant roles in promoting plasma cell formation. Journal of Immunology. 187 (4), 1643-1652 (2011).
- Anginot, A., Espeli, M., Chasson, L., Mancini, S. J., Schiff, C. Galectin 1 modulates plasma cell homeostasis and regulates the humoral immune response. Journal of Immunology. 190 (11), 5526-5533 (2013).
- Belnoue, E., et al. Homing and adhesion patterns determine the cellular composition of the bone marrow plasma cell niche. Journal of Immunology. 188 (3), 1283-1291 (2012).
- Belnoue, E., et al. APRIL is critical for plasmablast survival in the bone marrow and poorly expressed by early-life bone marrow stromal cells. Blood. 111 (5), 2755-2764 (2008).
- Huard, B., et al. APRIL secreted by neutrophils binds to heparan sulfate proteoglycans to create plasma cell niches in human mucosa. Journal of Clinical Investigation. 118 (8), 2887-2895 (2008).
- Ame-Thomas, P., et al. Human mesenchymal stem cells isolated from bone marrow and lymphoid organs support tumor B-cell growth: role of stromal cells in follicular lymphoma pathogenesis. Blood. 109 (2), 693-702 (2007).
- Ramachandrareddy, H., et al. BCL6 promoter interacts with far upstream sequences with greatly enhanced activating histone modifications in germinal center B cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (26), 11930-11935 (2010).
- Li, G., Zan, H., Xu, Z., Casali, P. Epigenetics of the antibody response. Trends in Immunology. 34 (9), 460-470 (2013).
- Miles, R. R., Crockett, D. K., Lim, M. S., Elenitoba-Johnson, K. S. Analysis of BCL6-interacting proteins by tandem mass spectrometry. Molecular & Cellular Proteomics. 4 (12), 1898-1909 (2005).
- McManus, S., et al. The transcription factor Pax5 regulates its target genes by recruiting chromatin-modifying proteins in committed B cells. The EMBO Journal. 30 (12), 2388-2404 (2011).
- Ahmadnejad, M., et al. Elevated expression of DNMT1 is associated with increased expansion and proliferation of hematopoietic stem cells co-cultured with human MSCs. Blood Research. 52 (1), 25-30 (2017).
- Beguelin, W., et al. EZH2 is required for germinal center formation and somatic EZH2 mutations promote lymphoid transformation. Cancer Cell. 23 (5), 677-692 (2013).
- Herviou, L., Cavalli, G., Cartron, G., Klein, B., Moreaux, J. EZH2 in normal hematopoiesis and hematological malignancies. Oncotarget. 7 (3), 2284-2296 (2016).
- Beguelin, W., et al. EZH2 enables germinal centre formation through epigenetic silencing of CDKN1A and an Rb-E2F1 feedback loop. Nature Communications. 8 (1), 877 (2017).
- Herviou, L., et al. PRC2 targeting is a therapeutic strategy for EZ score defined high-risk multiple myeloma patients and overcome resistance to IMiDs. Clinical Epigenetics. 10 (1), 121 (2018).
- Asangani, I. A., et al. Characterization of the EZH2-MMSET histone methyltransferase regulatory axis in cancer. Molecular Cell. 49 (1), 80-93 (2013).
- Pei, H., et al. MMSET regulates histone H4K20 methylation and 53BP1 accumulation at DNA damage sites. Nature. 470 (7332), 124-128 (2011).
- Cui, J., et al. EHMT2 inhibitor BIX-01294 induces apoptosis through PMAIP1-USP9X-MCL1 axis in human bladder cancer cells. Cancer Cell International. 15 (1), 4 (2015).
- Santo, L., et al. Preclinical activity, pharmacodynamic, and pharmacokinetic properties of a selective HDAC6 inhibitor, ACY-1215, in combination with bortezomib in multiple myeloma. Blood. 119 (11), 2579-2589 (2012).
- Amengual, J. E., et al. Dual Targeting of Protein Degradation Pathways with the Selective HDAC6 Inhibitor ACY-1215 and Bortezomib Is Synergistic in Lymphoma. Clinical Cancer Research. 21 (20), 4663-4675 (2015).
- Schoenhals, M., et al. Forced KLF4 expression increases the generation of mature plasma cells and uncovers a network linked with plasma cell stage. Cell Cycle. 15 (14), 1919-1928 (2016).
