Summary

Evaluatie van de Host-Pathogen reacties en werkzaamheid van het vaccin in muizen

Published: February 22, 2019
doi:

Summary

Hier presenteren we een elegante protocol voor in vivo evaluatie van vaccin effectiviteit en host immuunrespons. Dit protocol kan worden aangepast voor vaccin modellen die studeren virale, bacteriële of parasitische ziekteverwekkers.

Abstract

Vaccins zijn een 20th century medisch wonder. Ze hebben drastisch verminderd de morbiditeit en mortaliteit veroorzaakt door infectieziekten en bijgedragen tot een opvallende toename van de levensverwachting rond de hele wereld. Bepaling van de werkzaamheid van het vaccin blijft echter een uitdaging. Opkomende bewijs suggereert dat de huidige Acellulair vaccin (aPV) voor Bordetella pertussis (B. pertussis) suboptimaal immuniteit induceert. Daarom een belangrijke uitdaging is het ontwerpen van een volgende generatie vaccin dat protectieve immuniteit zonder de negatieve bijwerkingen van een geheel-cel vaccin (wPV induceert). Hier beschrijven we een protocol dat we gebruikt om te testen van de werkzaamheid van een veelbelovende, roman adjuvans immuun reacties op een beschermende Th1/Th17 fenotype scheef en promoot een betere Goedkeuringvande een uitdaging van B. pertussis uit de lymfkliertest luchtwegen. Dit artikel beschrijft het protocol voor muis immunisatie, bacteriële inoculatie weefsel oogsten en analyse van de immuunrespons. Met behulp van deze methode, binnen ons model, hebben wij met succes cruciale mechanismen ontlokte door een veelbelovende, volgende-generatie Acellulair kinkhoest vaccin toegelicht. Deze methode kan worden toegepast op elke infectieziekte model om te bepalen van de werkzaamheid van het vaccin.

Introduction

Vaccins vertegenwoordigen een van de grootste verworvenheden van de volksgezondheid van de 20e eeuw, maar we nog steeds niet volledig begrijpen de mechanismen waarmee succesvolle vaccins protectieve immuniteit stimuleren. De identificatie van moleculaire signaturen (bv., cel activatie markeringen, uitbreiding van cellulaire subtypen en patronen van genexpressie) veroorzaakt na vaccinatie een overvloed aan informatie biedt voor het voorspellen en het genereren van een doeltreffend immuunrespons. De complexiteit van de gastheer-pathogeen reacties kan niet voldoende worden gerepliceerd met behulp van in vitro cel cultuur systemen1. In vivo vaccin modellen zijn ontworpen om gelijktijdig meerdere soorten van immuun cellen binnen de host te evalueren. Dit biedt een voordeel wanneer karakteriseren vaccin antigeen verwerking en presentatie, differentiële cytokine secretie en uitbreiding van immuuncellen. Het protocol hier beschreven biedt een gedetailleerde methode om te bepalen van de werkzaamheid van het vaccin door evaluatie van de systemische en lokale immuunrespons en kwantificering van pathogen last in weefsels van belang. In het hier gegeven voorbeeld test de werkzaamheid van een experimenteel vaccin voor het pathogene agens Bordetella pertussis (B. pertussis).

B. pertussis is een gram-negatieve bacterie die is het etiologische agens van de respiratoire aandoeningen kinkhoest (pertussis)2,3. Nauw contact met besmette personen (symptomatisch of asymptomatisch) leidt tot transmissie, kolonisatie, en ziekte. Ondanks de aanzienlijke wereldwijde vaccin dekking4, kinkhoest wordt beschouwd als een resurging ziekte in veel landen over de hele wereld en is een belangrijke oorzaak van vermijdbare jeugd sterfgevallen5,6,7, 8. in 2015, B. pertussis en kinkhoest werden opgenomen in het nationale Instituut van allergie en besmettelijke ziekten (NIAID) opkomende infectieziekten pathogenen/lijst, nadruk op de behoefte aan ontwikkeling van een beter vaccin dat verleent langlevende protectieve immuniteit.

Een actief gebied van onderzoek bepalen van pertussis heropleving is momenteel de ontwikkeling van een vaccin (aPV) van de volgende generatie Acellulair kinkhoest met een optimale combinatie van roman hulpstoffen en antigenen om na te bootsen de immune reactie ontlokte door de geheel-cel kinkhoest vaccin (wPV)9. Met behulp van het protocol beschreven, we onlangs gemeld dat de wijziging van een huidige FDA-goedgekeurde aPV door toevoeging van een nieuwe adjuvans, Bordetella kolonisatie factor A (BcfA), resulteerden in efficiëntere daling van B. pertussis bacteriële verontreiniging vanaf muis longen10,11. Deze verhoogde bescherming werd vergezeld door het scheeftrekken van een aluin-geïnduceerde Th1/Th2 immune reactie op het meer beschermende Th1/Th17 immuun profiel10. Dit protocol is gedetailleerde en uitgebreide, waardoor de onderzoeker maximale informatie verkrijgen door de gelijktijdige evaluatie van host- en immuun reacties op een scala aan pathogenen.

Het protocol beschreven hier volgt het schema van de representatieve vaccin, afgebeeld in Figuur 1, om de optimale host immuunrespons.

Protocol

Alle experimenten met levende dieren werden uitgevoerd volgens een protocol goedgekeurd door de Ohio State University IACUC volgens IACUC richtlijnen. C57BL/6 muizen werden gebruikt in alle inentingen en infecties. Zowel vrouwelijke als mannelijke muizen worden gebruikt in elke groep per NIH richtsnoeren. Het aantal dieren per groep werd bepaald door macht berekeningen gebaseerd op de voorspelde verschillen in uitkomst tussen experimentele groepen. Bijvoorbeeld 8 muizen per groep levert 80% vermogen bij α = 0,05 (2-zijd…

Representative Results

Het model beschreven toont een methode om te evalueren van de efficiëntie van het vaccin en immuunresponsen tijdens gastheer-pathogeen interacties. Figuur 1 toont de planning van de representatieve vaccin gebruikt om te immunizeren en infecteren van muizen en oogsten van weefsels voor analyse. Figuur 2 toont de setup van het systeem van de verdoving werkzaam voor het opwekken van muizen, waardoor onderzoekers inentingen en bacte…

Discussion

Het uitgebreide protocol hier beschreven om te bestuderen van de vaccin-geïnduceerde immuniteit aan B. pertussis infectie zal ook toestaan dat evaluatie van host reacties op een verscheidenheid van andere ziekteverwekkers. Het protocol wordt beschreven methoden leveren inentingen te bepalen vaccin werkzaamheid volgende pathogen uitdaging en parallelle dissectie van immune functie. Bij de aanpassing van het protocol te bestuderen van andere ziekteverwekkers, zou verschillende parameters moeten worden gewijzigd. …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gesteund door 1R01AI125560-01 en start-up middelen aan The Ohio State University.

Materials

2L induction chamber Vet Equip 941444
Fluriso Vet One V1 501017 any brand is appropriate
Bordet Gengou Agar Base BD bioscience 248200
Casein Sigma C-7078
Casamino acids VWR J851-500G Strainer Scholte (SS) media components
L-Glutamic acid Research Products Int G36020-500
L-Proline Research Products Int P50200-500
Sodium Chloride Fisher BP358-10
Potassium Phosphate monobasic Fisher BP362-1
Potassium Chloride Fisher P217-500
Magnesium Chloride hexahydrate Fisher M2670-500G
Calcium Chloride Fisher C75-500
Tris base Fisher BP153-1
L-cysteine HCl Fisher BP376-100 SS media suplements
Ferrous Sulfate heptahydrate Sigma F-7002
Niacin Research Products Int N20080-100
Glutathione Research Products Int G22010-25
Ascorbic acid Research Products Int A50040-500
RPMI 1640 ThermoFisher Scientific 11875093
FBS Sigma F2442-500mL  any US source, non-heat inactivated
gentamicin ThermoFisher Scientific 15710064
B-mercaptoethanol Fisher  BP176-100
15mL dounce tissue grinder Wheaton 357544 any similar brand is appropriate
Cordless Hand Homogenizer Kontes/Sigma  Z359971-1EA any similar brand is appropriate
Instruments – scissors, curve scissors, forceps, fine forceps, triangle spreaders any brand is appropriate
3mL syringes BD bioscience 309657
15mL conical tubes Fisher  339651
1.5mL microfuge tubes Denville C2170
70um cell strainers Fisher  22363548
60mm plates ThermoFisher Scientific 130181
48-well tissue culture plates ThermoFisher Scientific 08-772-1C
1mL insulin syringe 28G1/2 Fisher Scientific/Excel Int. 14-841-31
Mouse IFN-gamma ELISA Ready-SET-Go! Kit Invitrogen / eBioscience 50-173-21
Mouse IL-17 ELISA Ready-SET-Go! Kit Invitrogen / eBioscience 50-173-77
Mouse IL-5 ELISA Ready-SET-Go! Kit Invitrogen / eBioscience 50-172-09

References

  1. Tacken, P. J., Figdor, C. G. Targeted antigen delivery and activation of dendritic cells in vivo: steps towards cost effective vaccines. Seminars in Immunology. 23 (1), 12-20 (2011).
  2. Kilgore, P. E., Salim, A. M., Zervos, M. J., Schmitt, H. J. Pertussis: Microbiology, Disease, Treatment, and Prevention. Clinical Microbiology Reviews. 29 (3), 449-486 (2016).
  3. Dorji, D., et al. Bordetella Pertussis virulence factors in the continuing evolution of whooping cough vaccines for improved performance. Medical Microbiology and Immunology. 207 (1), 3-26 (2018).
  4. Feldstein, L. R., et al. Global Routine Vaccination Coverage, 2016. Morbidity and Mortality Weekly Report. 66 (45), 1252-1255 (2017).
  5. Cherry, J. D. Epidemic pertussis in 2012–the resurgence of a vaccine-preventable disease. New England Journal of Medicine. 367 (9), 785-787 (2012).
  6. Celentano, L. P., et al. Resurgence of pertussis in Europe. The Pediatric Infectious Disease Journal. 24 (9), 761-765 (2005).
  7. McNabb, S. J., et al. Summary of notifiable diseases. Morbidity and Mortality Weekly Report p. 54 (53), 1-92 (2007).
  8. Sealey, K. L., Belcher, T., Preston, A. Bordetella pertussis epidemiology and evolution in the light of pertussis resurgence. Infection, Genetics, and Evolution. 40, 136-143 (2016).
  9. Warfel, J. M., Merkel, T. J. The baboon model of pertussis: effective use and lessons for pertussis vaccines. Expert Reviews of Vaccines. 13 (10), 1241-1252 (2014).
  10. Jennings-Gee, J., et al. The adjuvant Bordetella Colonization Factor A attenuates alum-induced Th2 responses and enhances Bordetella pertussis clearance from mouse lungs. Infection and Immunity. , (2018).
  11. Sukumar, N., Mishra, M., Sloan, G. P., Ogi, T., Deora, R. Differential Bvg phase-dependent regulation and combinatorial role in pathogenesis of two Bordetella paralogs, BipA and BcfA. Journal of Bacteriology. 189 (10), 3695-3704 (2007).
  12. Stainer, D. W., Scholte, M. J. A simple chemically defined medium for the production of phase I Bordetella pertussis. Journal of General Microbiology. 63 (2), 211-220 (1970).
  13. Bordet, J. Le microbe de le coqueluche. Annales de l’Institut Pasteur. 20, 731-741 (1906).
  14. Cook, M. J. . The Anatomy of the Laboratory Mouse. , (1965).
  15. Sutton, S. Accuracy of Plate Counts. Journal of Validation Techniques. 17 (3), 42-46 (2011).
  16. Conover, M. S., Sloan, G. P., Love, C. F., Sukumar, N., Deora, R. The Bps polysaccharide of Bordetella pertussis promotes colonization and biofilm formation in the nose by functioning as an adhesin. Molecular Microbiology. 77 (6), 1439-1455 (2010).
  17. Cattelan, N., Jennings-Gee, J., Dubey, P., Yantorno, O. M., Deora, R. Hyperbiofilm Formation by Bordetella pertussis Strains Correlates with Enhanced Virulence Traits. Infection and Immunity. 85 (12), (2017).
  18. Andreasen, C., Carbonetti, N. H. Pertussis toxin inhibits early chemokine production to delay neutrophil recruitment in response to Bordetella pertussis respiratory tract infection in mice. Infection and Immunity. 76 (11), 5139-5148 (2008).
  19. Mills, K. H., Gerdts, V. Mouse and pig models for studies of natural and vaccine-induced immunity to Bordetella pertussis. Journal of Infectious Diseases. 209, 16-19 (2014).
  20. Dunne, A., et al. A novel TLR2 agonist from Bordetella pertussis is a potent adjuvant that promotes protective immunity with an acellular pertussis vaccine. Mucosal Immunology. 8 (3), 607-617 (2015).
  21. Denoel, P., Godfroid, F., Guiso, N., Hallander, H., Poolman, J. Comparison of acellular pertussis vaccines-induced immunity against infection due to Bordetella pertussis variant isolates in a mouse model. Vaccine. 23 (46-47), 5333-5341 (2005).
  22. Marr, N., et al. Protective activity of the Bordetella pertussis BrkA autotransporter in the murine lung colonization model. Vaccine. 26 (34), 4306-4311 (2008).
  23. Feunou, P. F., Bertout, J., Locht, C. T- and B-cell-mediated protection induced by novel, live attenuated pertussis vaccine in mice. Cross protection against parapertussis. PLoS One. 5 (4), 10178 (2010).
  24. Mills, K. H., Ryan, M., Ryan, E., Mahon, B. P. A murine model in which protection correlates with pertussis vaccine efficacy in children reveals complementary roles for humoral and cell-mediated immunity in protection against Bordetella pertussis. Infection and Immunity. 66 (2), 594-602 (1998).
  25. Higgs, R., Higgins, S. C., Ross, P. J., Mills, K. H. Immunity to the respiratory pathogen Bordetella pertussis. Mucosal Immunology. 5 (5), 485-500 (2012).
  26. Alving, C. R. Design and selection of vaccine adjuvants: animal models and human trials. Vaccine. 20, 56-64 (2002).
  27. Ipp, M. M., et al. Adverse reactions to diphtheria, tetanus, pertussis-polio vaccination at 18 months of age: effect of injection site and needle length. Pediatrics. 83 (5), 679-682 (1989).
  28. Fessard, C., Riche, O., Cohen, J. H. Intramuscular versus subcutaneous injection for hepatitis B vaccine. Vaccine. 6 (6), 469 (1988).
  29. Bergeson, P. S., Singer, S. A., Kaplan, A. M. Intramuscular injections in children. Pediatrics. 70 (6), 944-948 (1982).
  30. Zhang, L., Wang, W., Wang, S. Effect of vaccine administration modality on immunogenicity and efficacy. Expert Review of Vaccines. 14 (11), 1509-1523 (2015).
  31. Ross, P. J., et al. Relative Contribution of Th1 and Th17 Cells in Adaptive Immunity to Bordetella pertussis: Towards the Rational Design of an Improved Acellular Pertussis Vaccine. PLoS Pathogens. 9 (4), 1003264 (2013).
  32. Warfel, J. M., Zimmerman, L. I., Merkel, T. J. Acellular pertussis vaccines protect against disease but fail to prevent infection and transmission in a nonhuman primate model. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 111 (2), 787-792 (2014).
  33. Allen, A. C., et al. Sustained protective immunity against Bordetella pertussis nasal colonization by intranasal immunization with a vaccine-adjuvant combination that induces IL-17-secreting TRM cells. Mucosal Immunology. , (2018).
  34. Solans, L., et al. IL-17-dependent SIgA-mediated protection against nasal Bordetella pertussis infection by live attenuated BPZE1 vaccine. Mucosal Immunology. , (2018).
  35. Miller, M. A., et al. Visualization of murine intranasal dosing efficiency using luminescent Francisella tularensis: effect of instillation volume and form of anesthesia. PLoS One. 7 (2), 31359 (2012).
  36. Sato, Y., Izumiya, K., Sato, H., Cowell, J. L., Manclark, C. R. Aerosol infection of mice with Bordetella pertussis. Infection and Immunity. 29 (1), 261-266 (1980).
  37. Warfel, J. M., Beren, J., Merkel, T. J. Airborne transmission of Bordetella pertussis. Journal of Infectious Diseases. 206 (6), 902-906 (2012).
  38. Scanlon, K. M., Snyder, Y. G., Skerry, C., Carbonetti, N. H. Fatal Pertussis in the Neonatal Mouse Model Is Associated with Pertussis Toxin-Mediated Pathology beyond the Airways. Infection and Immunity. 85 (11), (2017).
  39. Martinez de Tejada, G., et al. Neither the Bvg- phase nor the vrg6 locus of Bordetella pertussis is required for respiratory infection in mice. Infection and Immunity. 66 (6), 2762-2768 (1998).
  40. Higgins, S. C., Jarnicki, A. G., Lavelle, E. C., Mills, K. H. TLR4 mediates vaccine-induced protective cellular immunity to Bordetella pertussis: role of IL-17-producing T-cells. Journal of Immunology. 177 (11), 7980-7989 (2006).
  41. Mahon, B. P., Brady, M. T., Mills, K. H. Protection against Bordetella pertussis in mice in the absence of detectable circulating antibody: implications for long-term immunity in children. Journal of Infectious Diseases. 181 (6), 2087-2091 (2000).
  42. Karlsson, A. C., et al. Comparison of the ELISPOT and cytokine flow cytometry assays for the enumeration of antigen-specific T-cells. Journal of Immunological Methods. 283 (1-2), 141-153 (2003).
  43. Hagen, J., et al. Comparative Multi-Donor Study of IFNgamma Secretion and Expression by Human PBMCs Using ELISPOT Side-by-Side with ELISA and Flow Cytometry Assays. Cells. 4 (1), 84-95 (2015).
  44. Raeven, R. H. M., et al. Molecular and cellular signatures underlying superior immunity against Bordetella pertussis upon pulmonary vaccination. Mucosal Immunology. 11 (3), 1009 (2018).

Play Video

Cite This Article
Caution, K., Yount, K., Deora, R., Dubey, P. Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice. J. Vis. Exp. (144), e58930, doi:10.3791/58930 (2019).

View Video