Isolamento de tecidos embrionários e formação de órgãos quiméricoes codorna-frango, usando o exemplo do Timo
Summary
Este artigo fornece um método para isolar tecidos embrionários puros de codorna e galinha de embriões que podem ser combinados para formar ex vivo de órgãos quimérico.
Abstract
A capacidade de isolar tecidos embrionários foi um passo essencial para o estabelecimento do sistema de codorna-frango Quimera, que por sua vez tem proporcionado contribuições indiscutível para desvelar processos-chave na biologia do desenvolvimento.
Aqui é descrito um método otimizado para isolar tecidos embrionários de codornas e galinhas por microcirurgia e digestão enzimática, preservando suas propriedades biológicas. Após o isolamento, os tecidos de ambas as espécies são associados em um ensaio in vitro de organotypic para 48 h. codorniz e tecidos de frango podem ser discriminados por distintas características nucleares e marcadores moleculares, permitindo o estudo da Cruz-conversa entre celulares heterospecific Associação dos tecidos. Esta abordagem é, portanto, uma ferramenta útil para estudar interações do tecido complexo em processos de desenvolvimento com modificações espaciais altamente dinâmicas, tais como os que ocorrem durante a morfogênese da faringe e a formação do foregut órgãos derivados endoderme. Esta abordagem experimental foi desenvolvida para estudar as interações epitelial-mesenquimal durante os estágios iniciais de formação do timo. Neste, a endoderme-derivado rudimento prospectivo do Timo e derivados mesoderme mesênquima, foram isoladas a partir de embriões de codorna e galinha, respectivamente.
A capacidade dos tecidos associados para gerar órgãos pode ser ainda mais testada por enxertia-los para a membrana corioalantoicas (CAM) de um embrião de galinha. O CAM fornece nutrientes e permite trocas gasosas aos tecidos explantados. Após 10 dias de no desenvolvimento do ovo, os órgãos quiméricoes podem ser analisados nos explantes colhidos pelos métodos convencionais de morfológicos. Este procedimento também permite estudar as contribuições específicas do tecido durante a formação do órgão, de seu desenvolvimento inicial (desenvolvimento in vitro) para as etapas finais da organogênese (no desenvolvimento do ovo).
Finalmente, o método de isolamento melhorada também fornece tridimensional (3D) preservado tecidos embrionários, que também podem ser usados para análise topográfica de alta resolução de padrões de expressão gênica-tecido-específica.
Introduction
Na década de 1970, um sistema de Quimera de codorna-frango elegante foi desenvolvido por Le Douarin, abrindo novas vias para compreender o papel da migração celular e interacções celulares durante o desenvolvimento,1,2. O modelo foi concebido na premissa de que troca de células entre as duas espécies não incomodaria significativamente a embriogênese, confirmada mais tarde quando costumava estudar inúmeros processos de desenvolvimento, incluindo a formação do sistema nervoso e o hematopoiéticas sistemas de1. Tomando este último como um exemplo, as ondas cíclicas de progenitores hematopoiéticos, colonizando o rudimento epitelial tímico foi observado pela primeira vez usando o sistema de codorna-frango Quimera3. Por isso, o território em perspectiva do timo, a endoderme de malotes (3/4PP), terceiros e quarto lugar da faringe foi mecanicamente e enzimaticamente isolado de embriões de codorna (q) 15 a 30 – fase somite [dia embrionário (E) 1.5-E2.5]. Estas fases correspondem a galinha de Hamburger e Hamilton4 (HH) – estágios 12-17. Os procedimentos de isolamento começaram com o uso de tripsina para dissociar enzimaticamente a endoderme da mesênquima anexada. A endoderme isolada foi enxertada na região somatopleura do embrião de galinha (c) anfitrião na E3-E3.5 (HH-estágios 20-21). Este mesênquima heteróloga foi considerada “permissiva” para desenvolvimento de epitélio tímico, contribuindo também para a formação de órgão3. Depois, sucessivas ondas frango progenitor pelo sangue das células do hospedeiro se infiltrou a codorna doador tímicas epiteliais contraparte contribuindo para formação do Timo no embrião do anfitrião3.
Mais recentemente, uma versão modificada desta abordagem também provou-se para ser importante para o estudo de interações epitelial-mesenquimal durante os estágios iniciais de Timo formação5. A este respeito, os tecidos envolvidos na formação do Timo ectópico em embriões quimérico3 foram isolados, tanto a partir de embriões de doador e host e associados ex vivo. Um protocolo melhorado foi usado para isolar a endoderme 3/4PP de codorniz (E2.5-E3) e mesoderme frango somatopleura (E2.5-E3). Brevemente, tecidos embrionários foram isolados por microcirurgia e sujeitas a digestão in vitro pancreatina. Além disso, as condições de digestão enzimática, temperatura e tempo de incubação foram otimizadas de acordo com o tipo de tecido e grau de desenvolvimento (tabela 1).
Em seguida, os tecidos isolados foram associados em um organotypic em vitro sistema durante 48 h, como relatado anteriormente5,6. A associação in vitro de tecidos imita as locais interações celulares no embrião, superar algumas restrições da manipulação in vivo. Este sistema é particularmente útil para estudar interações celulares no complexo morphogenic eventos, tais como o desenvolvimento do aparato da faringe.
A contribuição de cada tecido na histogênese timo, bem como a capacidade da Associação heterospecific para gerar um timo pode ser ainda mais explorado usando a metodologia de CAM, anteriormente detalhadas5,7,8. Sucintamente, os tecidos cultivados foram enxertados o CAM de embriões cE8 e permitiu desenvolver-se em ovo por 10 dias. Então, formação de Timo foi avaliada por análise morfológica nos explantes colhidos. Conforme os estudos clássicos de codorna-galinha3, o epitélio tímico codorna foi colonizado por células progenitoras hematopoiéticas (HPCs), derivadas do embrião de galinha, que mais tarde foi mostrado para contribuir para o desenvolvimento de órgão9,10 . Os HPCs migraram do embrião para o Timo ectópico quimérico através do altamente vascularizado CAM5,7,8. Codorniz epitélio tímico derivado pode ser identificado por imuno-histoquímica utilizando anticorpos espécie-específicos (i.e., QCPN – MAb codorna PeriNuclear), superando a necessidade de marcadores moleculares de tecido-específica.
Esse método experimental, como a abordagem em duas fases, relatada no anterior publicação8, permite a modulação das vias de sinalização regular Administração de agentes farmacológicos durante in vitro e no desenvolvimento do ovo. Além disso, explantes podem ser colhidas em qualquer ponto do tempo do curso do experimento8.
Por último, o protocolo de isolamento aqui detalhado permite a preservação das propriedades naturais e 3D-arquitetura de tecidos embrionários, particularmente útil para o detalhamento de padrões em situ-expressão do gene embrionário territórios caso contrário inacessível por métodos convencionais. Além disso, abordagens de análise do transcriptoma, incluindo RNA-seq ou microarrays, também podem ser aplicadas em tecidos isolados sem a necessidade de marcadores genéticos, proporcionando uma análise de “omics” alto throughput tecido-específica.
Protocol
Representative Results
Discussion
O procedimento de isolamento de tecido embrionário detalhado aqui foi melhorado de técnicas anteriores para produzir embriões quiméricoes de codorna-frango em diferentes contextos biológicos3,5,6.
Essa abordagem é apropriada isolar tecidos embrionários puros sem a necessidade de manipulação genética ou o uso de marcadores de tecido-específica, que muitas vezes são indeterminadas, limitando…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores são gratos à Isabel Alcobia para a leitura crítica do manuscrito, a Mário Henriques para a narração e para Vitor Proa do serviço de histologia do Instituto de Histologia e Biologia do Desenvolvimento, Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, para suporte técnico. Estamos particularmente agradecidos a Paulo Caeiro e Hugo Silva da Unidade de audiovisuais (unidade do Audiovisual), Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa para seu compromisso excepcional para a produção deste vídeo. Reconhecemos a Leica Microsystems para gentilmente fornecendo um estereoscópio equipado com um sistema de vídeo e a Interaves – Sociedade Agro-Pecuária, S.A. por contribuir com codorna fertilizado ovos. Este trabalho foi apoiado pela Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).
Materials
| Chicken fertilized eggs (Gallus gallus) | Pintobar, Portugal | Poultry farm | |
| Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix) | Interaves, Portugal | Bird farm | |
| 15 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 50 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430290 | |
| 60 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 41 | |
| 100 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 48 | |
| Metal grid | Goodfellows | fine meshed stainless steel grid | |
| Membrane filter | Millipore | DTTP01300 | 0.6 mm Isopore membrane filter |
| Petri dish, 35 x 10 mm | Sigma-Aldrich | P5112 | |
| 60 x 30 mm pyrex bowls (Small size) | from supermarket | ||
| 100 x 50 mm pyrex bowls (Large size) | from supermarket | ||
| Transfer pipettes | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | 2 mL plastic pipet |
| Glass pasteur pipette | Normax | 5426015 | |
| Clear plastic tape | from supermarket | ||
| Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5 | BMA Biomedicals | T-1302 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Standart FBS | |
| Pancreatin | Sigma-Aldrich | P-3292 | Prepare a 25 mg/mL solution according to manufacturer's instructions; centrifuge and filter prior to aliquote and store at -20ºC. Aliquots can be kept frozen for several years. |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | QCPN | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 61870010 | |
| Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit | ELKEM/Silmid | RH141001KG | To prepare the back base for petri dish |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Thin forceps |
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | Curved scissors |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26001-30 | 0.3 mm Stainless steel pin |
| Micro spatula | Fine Science Tools | 10087-12 | Transplantation spoon |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | 0.2 mm Stainless steel microscalpel |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | 0.1 mm Stainless steel microscalpel |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Nickel plated pin holder |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Skimmer |
| Wecker Eye Scissor | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| Camera | Leica Microsystems | MC170 HD | |
| Microscope | Leica Microsystems | DM2500 | |
| NanoZoomer S360 Digital slide scanner | Hamamatsu Photonics | C13220-01 | |
| Stereoscope | Leica Microsystems | Leica M80 |
References
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