Isolierung der embryonalen Gewebe und die Bildung von Wachteln-Huhn Chimären Organe Thymus am Beispiel
Summary
Dieser Artikel enthält eine Methode, um reine embryonalen Gewebe von Wachteln und Hühner-Embryonen zu isolieren, die kombiniert werden können, um ex Vivo Chimären Organe.
Abstract
Die Fähigkeit zur embryonalen Gewebe isolieren war ein wesentlicher Schritt für die Gründung der Wachtel-Huhn Chimera-System, das wiederum unbestritten Beiträge zur Enthüllung Schlüsselprozesse in der Entwicklungsbiologie zur Verfügung gestellt hat.
Hierin ist eine optimierte Methode um embryonale Gewebe von Wachteln und Hühner durch Mikrochirurgie und enzymatische Verdauung unter Beibehaltung seiner biologischen Eigenschaften zu isolieren beschrieben. Nach Isolierung sind Gewebe aus beiden Arten in einem in-vitro-organotypischen Assay für 48 h. Wachtel und Huhn Gewebe können durch unterschiedliche Kernmerkmale und molekulare Marker ermöglicht die Untersuchung der zellulären Übersprechen zwischen diskriminiert werden artfremden Verband der Gewebe. Dieser Ansatz ist daher ein nützliches Werkzeug für die Untersuchung komplexer Gewebe Wechselwirkungen in Entwicklungsprozessen mit hochdynamischen räumliche Änderungen, wie die auftretenden pharyngealen Morphogenese und die Bildung von der foregut Entoderm abgeleitet Organe. Dieser Versuchsansatz wurde zuerst entwickelt, um die epitheliale-mesenchymale Interaktionen während der frühen Stadien der Thymus Bildung zu untersuchen. In diesem, das Entoderm abgeleitet prospektive Zebrafischembryonen Rudiment und Mesoderm abgeleitet Mesenchym waren bzw. von Wachteln und Hühner-Embryonen, isoliert.
Die Kapazität der damit verbundenen Gewebe, Organe zu generieren kann weiter durch Pfropfung sie auf chorioallantoic Membrane (CAM) von einem Huhn Embryo getestet werden. Die CAM liefert Nährstoffe und Gasaustausch der explantierten Gewebe ermöglicht. Nach 10 Tagen in Ovo Entwicklung können die Chimäre Organe in der geernteten Explantaten morphologische konventionell analysiert werden. Dieses Verfahren ermöglicht auch studieren gewebespezifischen Beiträge während Orgel-Formation, von seiner ersten Entwicklung (in vitro) in der Endphase der Organogenese (bei Ovo-Entwicklung).
Schließlich bietet die verbesserte Isolation-Methode auch dreidimensional (3D) erhalten embryonalen Gewebe, das auch für hochauflösende topografische Analyse der gewebespezifischer Genexpression Muster verwendet werden können.
Introduction
In den frühen 1970er Jahren entwickelte sich eine elegante Wachtel-Huhn-Chimäre-System von Le Douarin, öffnen neue Wege um zu verstehen, die Rolle der Zellwanderung und zellulären Interaktionen während der Entwicklung1,2. Das Modell wurde unter der Prämisse entwickelt, dass Zelle Austausch zwischen den beiden Arten Embryogenese, später bestätigt, wenn verwendet, um die zahlreichen Entwicklungsprozesse, einschließlich die Bildung des Nervensystems und der hämatopoetischen studieren nicht erheblich stören würde Systeme1. Wobei letzteres als Vorbild, die zyklischen Wellen der hämatopoetischen Vorläuferzellen besiedeln die Zebrafischembryonen epithelialen Rudiment wurde erstmals beobachtet mit Hilfe der Wachtel-Huhn Chimäre System3. Dafür war das prospektive Gebiet des Thymus, das Entoderm des dritten und vierten pharyngealen Beutel (3/4PP), in 15 bis 30 – Somiten Stadium [embryonalen Tag (E) 1,5-E2.5] mechanisch und enzymatisch von Wachteln (Q) Embryonen isoliert. Diese Stufen entsprechen Huhn Hamburger und Hamilton4 (HH) – Stufen 12-17. Die Isolierungsmaßnahmen begann mit dem Einsatz von Trypsin enzymatisch das Entoderm aus der beigefügten Mesenchym distanzieren. Das isolierte Entoderm wurde in der Somatopleura Region eines Host Huhn (c) Embryos bei E3-3,5 (HH-Stufen 20-21) veredelt. Diese heterologen Mesenchym galt “permissive” Zebrafischembryonen Epithel Entwicklung tragen auch zur Orgel Formation3. Danach infiltriert aufeinanderfolgende Wellen Huhn Host Blut übertragbare Vorläuferzellen der Wachtel Spender Zebrafischembryonen epithelialen Gegenstück zur Thymus-Bildung in der Host-Embryo-3.
Vor kurzem wurde eine modifizierte Version dieses Ansatzes als auch wichtig für das Studium epitheliale-mesenchymale Interaktionen während der frühen Stadien der Thymus Bildung5erwiesen. In dieser Hinsicht waren beteiligt an der Gründung des ektopische Thymus Chimäre Embryonen3 Gewebe isoliert, beide aus Spender und Host Embryonen und ex Vivo verbunden. Eine verbesserte Protokoll wurde verwendet, um die Wachteln 3/4PP Entoderm (E2.5-E3) und das Huhn Somatopleura Mesoderm (E2.5-E3) zu isolieren. Kurz, wurden embryonale Gewebe isoliert durch Mikrochirurgie und nach Maßgabe der in-vitro-Pankreatin Verdauung. Außerdem wurden die Bedingungen der enzymatischen Verdauung, Temperatur und Zeit der Inkubation nach Gewebetyp und Entwicklungsstadium (Tabelle 1) optimiert.
Als nächstes wurden isolierte Gewebe in ein organotypischen in Vitro System für 48 h, wie bereits berichtet5,6verbunden. Der in-vitro-Verband der Gewebe imitiert die lokalen zellulären Interaktionen im Embryo, einige Einschränkungen der in-vivo Manipulation zu überwinden. Dieses System ist besonders nützlich, um zelluläre Interaktionen in komplexen morphogenen Ereignisse, z. B. die Entwicklung der pharyngealen Vorrichtung zu untersuchen.
Der Beitrag der einzelnen Gewebe im Thymus Histogenese, sowie die Fähigkeit des Vereins artfremden eine Thymus generieren kann weiter erforscht mit Hilfe der CAM-Methodik, zuvor detaillierte5,7,8. Kurz und bündig, waren die kultivierten Gewebe aufgepfropft CAM cE8 Embryonen und erlaubt, in Ovo für 10 Tage zu entwickeln. Dann wurde Thymus Bildung durch morphologische Analyse in der geernteten Explantaten bewertet. Wie in den Altertumswissenschaften Wachtel-Huhn3wurde der Wachtel Zebrafischembryonen Epithel von hämatopoetischen Vorläuferzellen (HPCs) abgeleitet vom Huhn Embryo, die später gezeigt wurde, beitragen zur Orgel Entwicklung9,10 besiedelt. . Die HPCs migriert vom Embryo, ektopische Chimären Thymus bis stark vaskularisierte CAM5,7,,8. Wachtel abgeleiteten Zebrafischembryonen Epithel von Immunohistochemistry mit Spezies-spezifische Antikörper (d. h. QCPN – MAb Wachtel Perinukleäre), Überwindung der Notwendigkeit einer Gewebe-spezifische molekulare Marker identifiziert werden kann.
Diese experimentelle Methode ermöglicht als die zweistufigen Ansatz in früheren Veröffentlichung8, berichtet die Modulation der Signalwege durch regelmäßige Gabe von pharmakologischen Wirkstoffen bei in-vitro- und in Ovo Entwicklung. Explantaten können auch zu jedem Zeitpunkt des Kurses der Experiment8geerntet werden.
Schließlich ermöglicht die Isolierung Protokoll hier detailliert die Erhaltung der natürlichen Eigenschaften und 3D-Architektur der embryonalen Gewebe, besonders nützlich für die Detaillierung in-situ-gen-Expressionsmuster von embryonalen Territorien ansonsten unzugänglich durch konventionelle Methoden. Transkriptom-Analyse-Ansätze, einschließlich RNA-Seq oder Microarrays, können darüber hinaus auch in isolierten Geweben ohne genetische Marker und bietet gleichzeitig eine gewebespezifische Hochdurchsatz “Omics” Analyse angewendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das embryonale Gewebe isoliert Verfahren hier detailliert wurde aus früheren Techniken herstellen Wachtel-Hühnerembryos Chimären in verschiedenen biologischen Zusammenhängen3,5,6verbessert.
Dieser Ansatz eignet sich für reine embryonalen Gewebe ohne Genmanipulation oder die Verwendung von Gewebe-spezifische Marker, die sind oft unbestimmt, Begrenzung der Verwendung von gentechnisch veränderten T…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren sind dankbar für die kritische Lektüre des Manuskripts, Isabel Alcobia Mário Henriques für video Erzählung und Vitor Proa aus der Histologie-Service des Instituto de Histologia e Biologia Desenvolvimento, Faculdade de Medicina de Lisboa Universidade de Lisboa, für den technischen Support. Wir sind insbesondere verpflichtet, Paulo Caeiro und Hugo Silva aus Unidade de Audiovisuais (Referat audiovisuelle Medien), Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa für ihr herausragendes Engagement für die Produktion von diesem Video. Wir anerkennen Leica Microsystems freundlicherweise dafür ein Stereoskop, ausgestattet mit einem Videosystem und Interaves – Sociedade Agro-Pecuária, S.A. für den Beitrag mit Wachteln Eier befruchtet. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).
Materials
| Chicken fertilized eggs (Gallus gallus) | Pintobar, Portugal | Poultry farm | |
| Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix) | Interaves, Portugal | Bird farm | |
| 15 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 50 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430290 | |
| 60 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 41 | |
| 100 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 48 | |
| Metal grid | Goodfellows | fine meshed stainless steel grid | |
| Membrane filter | Millipore | DTTP01300 | 0.6 mm Isopore membrane filter |
| Petri dish, 35 x 10 mm | Sigma-Aldrich | P5112 | |
| 60 x 30 mm pyrex bowls (Small size) | from supermarket | ||
| 100 x 50 mm pyrex bowls (Large size) | from supermarket | ||
| Transfer pipettes | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | 2 mL plastic pipet |
| Glass pasteur pipette | Normax | 5426015 | |
| Clear plastic tape | from supermarket | ||
| Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5 | BMA Biomedicals | T-1302 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Standart FBS | |
| Pancreatin | Sigma-Aldrich | P-3292 | Prepare a 25 mg/mL solution according to manufacturer's instructions; centrifuge and filter prior to aliquote and store at -20ºC. Aliquots can be kept frozen for several years. |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | QCPN | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 61870010 | |
| Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit | ELKEM/Silmid | RH141001KG | To prepare the back base for petri dish |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Thin forceps |
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | Curved scissors |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26001-30 | 0.3 mm Stainless steel pin |
| Micro spatula | Fine Science Tools | 10087-12 | Transplantation spoon |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | 0.2 mm Stainless steel microscalpel |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | 0.1 mm Stainless steel microscalpel |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Nickel plated pin holder |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Skimmer |
| Wecker Eye Scissor | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| Camera | Leica Microsystems | MC170 HD | |
| Microscope | Leica Microsystems | DM2500 | |
| NanoZoomer S360 Digital slide scanner | Hamamatsu Photonics | C13220-01 | |
| Stereoscope | Leica Microsystems | Leica M80 |
References
- Le Douarin, N. The Nogent Institute–50 years of embryology. The International Journal of Developmental Biology. 49 (2-3), 85-103 (2005).
- Le Douarin, N. M., Teillet, M. A. The migration of neural crest cells to the wall of the digestive tract in avian embryo. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 30 (1), 31-48 (1973).
- Le Douarin, N. M., Jotereau, F. V. Tracing of cells of the avian thymus through embryonic life in interspecific chimeras. Journal of Experimental Medicine. 142 (1), 17-40 (1975).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
- Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos. 발생학. 361 (2), 208-219 (2012).
- Takahashi, Y., Bontoux, M., Le Douarin, N. M. Epithelio–mesenchymal interactions are critical for Quox 7 expression and membrane bone differentiation in the neural crest derived mandibular mesenchyme. Embo Journal. 10 (9), 2387-2393 (1991).
- Figueiredo, M., et al. Notch and Hedgehog in the thymus/parathyroid common primordium: Crosstalk in organ formation. 발생학. 418 (2), 268-282 (2016).
- Figueiredo, M., Neves, H. Two-step Approach to Explore Early-and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm Video Link. Journal of Visualuzed Experiments. , (2018).
- Nehls, M., et al. Two genetically separable steps in the differentiation of thymic epithelium. Science (New York, N.Y.). 272 (5263), 886-889 (1996).
- Morahan, G., et al. The nu gene acts cell-autonomously and is required for differentiation of thymic epithelial progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (12), 5742-5746 (1996).
- Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).
- Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling. Cells Tissues Organs. 193 (6), 393-403 (2011).
- Zou, D., et al. Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1. 발생학. 293 (2), 499-513 (2006).
- Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenetic and Genome Research. 117 (1-4), 231-239 (2007).
- Nowak-sliwinska, P., Segura, T., Iruela-arispe, M. L., Angeles, L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
- Uematsu, E., et al. Use of in ovo chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice. Comparative Medicine. 64 (4), 264-269 (2014).
- Martyn, I., Kanno, T. Y., Ruzo, A., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. Self-organization of a human organizer by combined Wnt and Nodal signaling. Nature. 558 (7708), 132-135 (2018).
